高产酒精酵母的选育及发酵工艺条件与动力学研究

论文摘要

随着石油能源日益耗竭,国内外许多科学家开始研究利用生物质生产燃料乙醇。目前,我国在这方面的主要研究是利用玉米作为原材料生产燃料乙醇。由于玉米是我国主要的粮食作物,大量用来生产乙醇将会造成潜在的粮食危机,因而利用非粮生物质原料生产燃料乙醇对于我国现状来说将成为一项迫切、具有重要现实意义的任务。利用甘蔗生成燃料乙醇可以充分弥补利用粮食作为原材料的不足,巴西利用甘蔗生产燃料酒精的成功充分说明了这一点。本文主要从菌株YS518rRNA的分子鉴定,高产酒精酵母的选育,突变株生理生化的研究,发酵工艺条件的优化及乙醇发酵动力学等几个方面进行了研究。首先利用分子生物学技术克隆了出发酵母菌株YS518rRNA序列,进行了序列鉴定并构建进化树;其次以YS5作为试验出发菌株,制备原生质体进行紫外诱变,通过初筛和复筛获得一株高产酒精酵母突变株YS5-1。利用甘蔗汁发酵试验表明该突变株发酵液最终酒份含量高达10.4%（v/v）,较出发菌株提高8.3%,糖转化率高达94.5%。通过5次连续传代培养其突变株乙醇产量保持稳定。在此基础上又进一步对酵母YS5-1进行了生理生化方面的研究,其结果表明该菌最适生长温度为30℃,最适生长pH值为5.0,在耐酒精、耐盐、耐高浓度葡萄糖方面稍优于菌株YS5。利用均匀设计软件设计试验进行了发酵工艺优化,确定了利用甘蔗汁进行乙醇发酵最佳工艺条件:发酵培养基:糖度17BX,酵母膏1.1%、硫酸铵0.9%、磷酸二氢钾0.4%、硫酸镁0.37%;发酵条件:初始pH值4.4、接种量6%、发酵温度28℃,静止发酵168h,乙醇产量达11.3%。最后采用7L发酵罐进行分批乙醇发酵,定时检测发酵液菌体干重、残糖量、乙醇产量。以Logistic方程和Luedeking-Piret方程为基础,建立了该菌在发酵过程中菌体生长、产物形成和底物消耗的动力学模型,其模型能较好地反应了菌体生长、底物消耗和产物生成的变化规律,对实际乙醇生产具有一定的指导意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 目录
• 第1章 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.1.1 燃料乙醇的研究背景
• 1.1.2 发展燃料乙醇的现实意义
• 1.1.2.1 乙醇的主要用途
• 1.1.2.2 燃料乙醇的定义、优点及发展前景
• 1.1.3 国内外燃料乙醇的发展概况
• 1.1.3.1 巴西燃料酒精工业的发展概况
• 1.1.3.2 美国燃料酒精工业的发展概况
• 1.1.3.3 中国燃料酒精工业的发展概况
• 1.1.3.4 其它国家燃料酒精工业的发展概况
• 1.2 酿酒酵母选育方法的研究进展
• 1.2.1 常规育种技术方法的运用
• 1.2.2 现代育种技术方法的运用
• 1.2.2.1 原生质体融合技术的运用
• 1.2.2.2 微生物分子育种技术的应用
• 1.3 酿酒酵母酒精耐性方面的研究进展
• 1.3.1 酿酒酵母细胞膜与耐酒精特性的研究
• 1.3.2 酵母蛋白质与耐酒精特性的关系
• 1.3.3 海藻糖与酵母耐酒精特性的研究
• 1.3.4 培养基组成与酵母耐酒精特性的研究
• 1.4 利用甘蔗生产燃料乙醇
• 1.4.1 能源甘蔗的基本概念
• 1.4.2 利用甘蔗生成燃料乙醇的现实意义
• 1.4.3 甘蔗生产燃料乙醇的优点
• 1.5 本论文研究的目的意义及内容
• 518SrRNA基因序列与鉴定'>第2章 出发菌株YS₅18SrRNA基因序列与鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 菌种
• 2.1.1.2 酶和主要试剂
• 2.1.1.3 培养基
• 2.1.1.4 主要仪器与设备
• 2.1.1.5 反应引物
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 酵母基因组DNA的快速提取
• 2.1.2.2 聚合酶链式反应（PCR）扩增18SrRNA基因
• 2.1.2.3 目的产物的胶回收（胶回收试剂盒）
• 2.1.2.4 大肠杆菌TOP10感受态细胞的制备
• 2.1.2.5 目的产物的连接与转化
• 2.1.2.6 菌落PCR验证
• 2.1.2.7 18SrRNA基因测序与进化树的构建
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 酵母基因组DNA的提取
• 2.2.2 酿酒酵母18SrRNA基因产物的扩增
• 2.2.3 18SrRNA胶回收
• 2.2.4 转化子菌落PCR验证
• 2.2.5 18SrRNA基因序列测序结果
• 2.2.6 酿酒酵母18S rRNA基因系统进化树的构建与分析
• 2.3 小结
• 第3章 适合甘蔗汁发酵高产酒精酵母的选育
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.1.1 菌种
• 3.2.1.2 主要试剂
• 3.2.1.3 培养基
• 3.2.1.4 主要设备和仪器
• 3.2.2 方法
• 5生长曲线的测定'>3.2.2.1 酿酒酵母YS₅生长曲线的测定
• 3.2.2.2 酵母原生质体制备菌龄的确定
• 3.2.2.3 酵母原生质体制备率和再生率的确定
• 3.2.2.4 原生质体最佳紫外诱变时间的确定
• 3.2.2.5 酵母突变菌的初筛
• 3.2.2.6 酵母突变菌的复筛（发酵栓法）
• 3.2.2.7 突变株发酵液乙醇产量及残糖的分析
• 3.2.2.8 突变菌株遗传稳定性实验
• 3.2.2.9 相关分析方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 酵母生长曲线的测定
• 3.3.2 原生质体制备菌龄的确定
• 3.3.3 原生质体制备的情况
• 3.3.4 原生质体最佳诱变时间的确定
• 3.3.5 高产乙醇酵母酵母菌株的筛选
• 3.3.5.1 酵母突变株初筛结果
• 3.3.5.2 酵母突变菌复筛结果
• 3.3.6 乙醇标准曲线的制作
• 3.3.7 葡萄糖溶液标准曲线的制作
• 5-1发酵液乙醇含量及残糖的分析'>3.3.8 突变株YS_5-1发酵液乙醇含量及残糖的分析
• 5-1遗传稳定性实验'>3.3.9 突变株YS_5-1遗传稳定性实验
• 3.3.10 讨论
• 3.4 小结
• 5-1生理生化研究及发酵工艺条件的优化'>第4章 酵母YS_5-1生理生化研究及发酵工艺条件的优化
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.1.1 实验菌种
• 4.2.1.2 相关试剂
• 4.2.1.3 培养基
• 4.2.1.4 主要仪器
• 4.2.2 方法
• 4.2.2.1 最适生长温度的确定
• 4.2.2.2 最适pH值的确定
• 4.2.2.3 酵母耐酒精能力的比较
• 4.2.2.4 酵母耐盐、耐葡萄糖能力的比较
• 4.2.2.5 不同起始pH值对产乙醇能力的影响
• 4.2.2.6 不同温度对产乙醇能力的影响
• 4.2.2.7 不同无机氮源对产乙醇能力的影响
• 4.2.2.8 不同装液量对产乙醇能力的影响
• 4.2.2.9 不同接种量对产乙醇能力的影响
• 4.3 结果与分析
• 5-1生长的影响'>4.3.1 不同温度对酵母YS_5-1生长的影响
• 5-1生长的影响'>4.3.2 起始pH值对酵母YS_5-1生长的影响
• 5和YS_5-1耐性的研究'>4.3.3 酵母YS₅和YS_5-1耐性的研究
• 4.3.3.1 不同酒精含量对两株酵母生长的影响
• 4.3.3.2 不同酒精含量对两株酵母死亡率的影响
• 4.3.3.3 不同盐浓度对两株酵母生长的影响
• 4.3.3.4 不同葡萄糖浓度对酵母生长的影响
• 5-1产乙醇能力的影响'>4.3.4 发酵条件对YS_5-1产乙醇能力的影响
• 4.3.4.1 起始pH值对乙醇产量的影响
• 4.3.4.2 不同温度对乙醇产量的影响
• 4.3.4.3 不同无机氮源对乙醇产量的影响
• 4.3.4.4 不同装液量对乙醇产量的影响
• 4.3.4.5 不同接种量对乙醇产量的影响
• 4.3.5 利用均匀设计进行发酵工艺条件的优化
• 4.3.5.1 利用均匀设计软件对发酵条件进行优化
• 4.3.5.2 最佳发酵条件组合的验证
• 4.3.5.3 利用均匀设计软件对发酵培养基所添加营养物质进行优化
• 4.3.5.4 培养基所添加营养物质最佳组合的验证
• 4.4 小结
• 第5章 乙醇发酵动力学的研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.1.1 实验菌种
• 5.2.1.2 培养基
• 5.2.1.3 相关仪器
• 5.2.2 方法
• 5.2.2.1 实验方法
• 5.2.2.2 相关分析方法
• 5.2.2.3 发酵动力学模型
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 乙醇发酵过程曲线
• 5.3.2 菌体生长动力学方程的建立
• 5.3.3 产物生成动力学方程的建立
• 5.3.4 底物消耗动力学方程的建立
• 5.4 小结
• 结论
• 附录
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历