论文摘要
目的:卵巢癌因为缺乏有效的早期诊断方法,被发现时往往多为晚期,其死亡率居妇科肿瘤首位。目前,对卵巢癌患者化疗仍是最重要的辅助手段,尤其在晚期卵巢癌治疗中具有极为重要的意义。加之卵巢癌细胞在化疗过程中容易产生耐药,因此寻找更为有效的化疗方案是提高卵巢癌疗效的重要途径。目前多选用顺铂为一线化疗药物,同时由二线化疗药物与之配伍,其中以拓扑异构酶II（topoII）抑制剂最为常用,二者可通过不同的作用机制抑制肿瘤细胞的繁殖[1]。许多研究表明,癌细胞对DNA topoII抑制剂的敏感性依赖于topoIIα的表达,如果癌细胞中topoIIα表达减少,则其对DNA topoII抑制剂的敏感性就减低,且容易产生耐药。在对细胞株和临床样本的观察中发现,耐药细胞中topoIImRNA表达减少、启动子活性降低,转录因子NF-Y和Sp1水平下降。人类topoIIα和β启动子区均含GC盒,及数各个CCAAT盒（ICBs）。NF-Y和Sp1能够分别作用于topoII基因启动子区的ICBs和GC盒,调控topoIIα和β的表达,且同时发现NF-Y和Sp1具有协同作用[2]。阴梅云教授在此前的研究首次发现,CDDP能够上调卵巢癌细胞SKOV3中同工酶α和β的表达,猜想这可能与topoII启动子区转录因子的调节有关。本实验选用顺铂和足叶乙甙合用,通过体外作用于卵巢癌细胞系SKOV3,采用免疫印迹方法观察用药前后肿瘤细胞内转录因子NF-Y和Sp-1的表达,进一步了解CDDP对topoII基因上游调控因素的影响。全面探讨药物作用机理,从而减少耐药性产生,为临床合理配伍用药提供理论依据。方法:1细胞培养卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV3为本实验室所冻存。以内含10 %胎牛血清、100 IU·mL-1青霉素、100μg·mL-1链霉素、4 mmol·L-1谷氨酰胺及1 mol·L-1 HEPES的RPMI-1640培养液,置37℃、5 % CO2条件下体外培养。2药物浓度选择、试验分组参考药物的血浆峰浓度（PSC）,其中CDDP为3μg/ml;VP-16为5μg/ml,进行试验分组。实验组:①CDDP组:分别用CDDP的1/10PSC浓度,PSC浓度,10×PSC浓度作用于细胞。②VP-16+CDDP组:用VP-16的PSC浓度分别与CDDP的上述三种浓度合用。同时设空白对照组。3核蛋白的抽提及Western blot分析3.1核蛋白的抽提及含量测定取对数生长期细胞,经0.25%胰蛋白酶消化后,加入培养液吹打均匀,以1×105细胞浓度接种于高压过的无菌培养瓶中, 24h后加入药物与细胞共培养。取培养细胞5×106-7个/ml弃去培养液,细胞用预冷的PBS洗涤两遍;加入1ml预冷的PBS,用细胞刮刀将细胞刮下,将此混合液移入1 mL Eppendorf管中,4℃,3 000g离心10min,弃上清。通过两次核裂解法裂解细胞,具体操作步骤参照（核蛋白抽提试剂盒操作步骤）。将最后所得上清转入一预冷的洁净微量离心管,即得核蛋白。用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白浓度,分装,-70℃保存,避免反复冻融。3.2 Western blot分析3.2.1上样:各种目的蛋白的测定取其适宜上样量,对NF-Y和Sp1蛋白的测定,分别上样进行Western blot分析。在4℃条件下分别经8%和10%SDS-PAGE凝胶电泳后。根据上样蛋白的分子量并依据预染蛋白分子量Marker切下大小合适的凝胶,并切去凝胶左上角标记凝胶方位。3.2.2转膜:以110 mA恒流状态下,4℃电转移3.03.5 h,用半干式电转移仪转至硝酸纤维素膜上.3.2.3封闭:转移结束时,取出硝酸纤维素膜（每次取出都要注意分清正反面）,在封闭液中4℃过夜。封闭结束后,在TS-1脱色摇床上TPBS洗膜3次,每次10 min,经5%脱脂奶4℃封闭过夜。封闭后加入一抗,兔抗人NF-YA多克隆抗体、兔抗人SP1多克隆抗体, 4°C孵育过夜。同样用TPBS洗膜3次,每次10 min,加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶5000）二抗,室温孵育2h。3.2.4显色:反应结束后,取出硝酸纤维素膜,同前,用TPBS洗膜3次,PBS洗膜1次,每次10 min,将膜从PBS液中取出,在滤纸上吸干,置干净小平皿中,用ECL或DAB显色后分析结果。4统计学方法:所有资料均用计算机统计软件SPSS14.0进行统计分析。实验数据以均数±标准差（X±S）表示,组间比较采用单因素方差分析,蛋白印迹试验应用HPIAS-1000系统进行条带峰值面积和光密度定量。判断标准:以P<0.05,为有统计学意义。结果:Western blot分析显示,分别在105 kD和32 kD位置附近出现Sp1和NF-Y的蛋白条带,光密度值分析结果显示（见table2、3）:1 NF-Y蛋白的表达:不同浓度顺铂作用后,NF-Y蛋白表达量均明显高于对照组,经统计分析,三组与对照组相比,差别均有显著性,P<0.01。不同浓度顺铂组间比较,差别有显著性,P<0.01,且随顺铂浓度的增高,NF-Y蛋白的表达依次增强（见Fig1 B）。单用VP-16作用组,NF-Y蛋白的表达则明显低于对照组（1.45±0.12vs 1.99±0.02）,差别有显著性,P<0.01。而两药合用的三组与对照组（1.99±0.02）相比,NF-Y蛋白的表达量略有升高,经统计学处理,差异有显著性,P<0.05。（Fig.1 A B）2 SP1蛋白的表达:不同浓度顺铂作用后,Sp1蛋白表达量均明显高于对照组,差异有显著性,P<0.01。同时发现不同作用浓度的顺铂组间比较, SP1蛋白表达量依次增加,但经统计学分析,只有10CDDP与1/10CDDP组比较,差异有显著性,P<0.05。VP-16作用组与对照组相比,Sp1蛋白于药物作用后表达量有明显降低（0.38±0.03 vs 0.66±0.02）,差别有显著性,P<0.01。两药合用的组Sp1蛋白的表达量均有增加,与对照组（0.66±0.02）相比,差异有显著性,P<0.05。（Fig.2 C D）结论:本实验结果表明,CDDP作用后,转录因子NF-Y和Sp1的表达水平增加,进而可能通过NF-Y和Sp1分别与topoIIα和β基因中特定的序列结合,上调SKOV3卵巢癌细胞中topoII同功酶α和β表达,使卵巢癌细胞对topoII抑制剂敏感性增强。结合此前我们研究发现的CDDP对topoII基因下游产物表达的影响,全面探讨药物的作用机理,对减少CDDP的耐药性,提高相关肿瘤的治疗疗效具有参考意义。