论文摘要
第一部分前列腺癌差异蛋白质组学研究目的：通过同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ）为基础的蛋白质组学研究筛选出前列腺癌发生、发展过程中相关的差异表达蛋白以便发现前列腺癌的相关生物标记物,并对这些差异表达蛋白进行生物信息学分析,了解这些蛋白的功能与调控情况。材料和方法：将前列腺穿刺活检的组织标本经病理医师切片诊断后分为3组：良性前列腺增生组（n=20）、前列腺癌组（n=20例）以及前列腺上皮内瘤组（n=10）。然后对这些组织标本进行蛋白提取、定量和酶解。iTRAQ试剂标记后（其中114标记良性前列腺增生组,116标记前列腺癌组,117标记前列腺上皮内瘤组）,进行二维液相色谱-串联质谱（2DLC-MS/MS）分析。利用ProteinPilot软件（版本3.0）对MS/MS肽段进行分析,在International Swissprot （090210,human）数据库中搜寻蛋白并定量。116：114或116：117差异表达蛋白界值设定：大于1.5倍或小于0.66倍（P<0.05）认为二者之间存在显著差异表达。相对于良性前列腺增生,前列腺癌的差异表达蛋白（即116：114的差异表达蛋白）在本研究重点被探讨。我们对前列腺癌的差异表达蛋白Tumor protein D52（癌蛋白D52,TPD52）、Prohibitin-2（抑制素-2）、Elongation factor Tu（延伸因子Tu, EF-Tu）及Decorin（核心蛋白多糖）进行了Western-blot验证。然后我们应用MetaCore（GeneGo）软件对差异表达蛋白进行生物信息学分析,包括GO分析、转录调控网络和转录因子网络分析。结果：从International Swissprot （090210,human）数据库中总共鉴定出760种蛋白。在这些鉴定的蛋白中,PSA（前列腺特异抗原）和PAP（前列腺酸性磷酸酶）是已知的而且已经广泛用于临床的两个生物标记物。基于筛选差异表达蛋白的条件,相对于良性前列腺增生,前列腺癌差异表达蛋白共有46个,其中20个蛋白明显上调,26个蛋白明显下调。在这些差异表达蛋白中,诸如线粒体相关蛋白、细胞外基质蛋白等已被证实在前列腺癌发生、发展中发挥重要作用。在我们鉴定的差异表达白中,TPD52、Prohibitin-2、EF-Tu在前列腺癌中分别上调4.25倍、4.57倍和3.02倍,而Decorin下调0.43倍。Western-blot结果显示相对于良性前列腺增生组织,TPD52、EF-Tu以及Prohibitin-2在前列腺癌中明显高表达（P<0.05）,相反,相比前列腺癌组织,Decorin在良性前列腺增生组织中高表达（P<0.05）。Western-blot结果与这些差异表达蛋白的变化相符合。而差异表达蛋白Periostin将作为我们的兴趣蛋白,在本论文的第二部分重点被探讨。根据GO数据库,我们按差异表达蛋白的富集度进行排序,挑选出了前10位的亚细胞定位、分子功能和生物过程。结果提示差异表达蛋白大部分定位于细胞外区域,发挥连接功能而且涉及平滑肌生物过程、细胞骨架的组装、抗凋亡、细胞粘附等生物过程。此外,我们按差异表达蛋白的富集度进行排序,挑选出了前5位的转录调控网络分别由SP1、p53、YY1、Androgen receptor（雄激素受体,AR）以及c-Myc调控,处于第1位的转录因子网络为以Slug为核心的调控相关网络。这些转录因子参与差异表达蛋白的调控,涉及抗凋亡、细胞粘附调控、细胞周期调控等生物过程。结论：iTRAQ技术为我们从整体上了解在前列腺癌发生、发展过程中蛋白质的表达差异,从而筛选出有意义的生物标记物提供了一个良好的平台。本研究通过iTRAQ技术分析得到的前列腺癌差异表达蛋白可靠,并且揭示了线粒体相关蛋白以及细胞外基质蛋白在前列腺癌发生、发展中的作用。生物信息学的研究方法可以拓展我们的思路和视野,有助于我们进一步从整体上了解差异表达蛋白的功能和调控。本研究通过生物信息学分析得到的调控差异表达蛋白的转录因子SP1、P53、YY1、AR、c-Myc以及Slug参与调控前列腺癌的发生、发展过程中的诸多生物过程。第二部分Periostin在前列腺癌中的表达及功能研究目的：探讨Periostin在前列腺癌组织和前列腺癌细胞中的表达。进一步以前列腺癌LNCap细胞系为研究对象,观察通过RNA干扰沉默Periostin表达后对前列腺癌LNCap细胞生长、侵袭及凋亡的影响。材料与方法：我们应用（？）Vestern-blot和免疫组化的方法验证了Periostin在前列腺癌组织中的表达情况。接着我们应用免疫荧光、Western-blot以及RT-PCR的方法检测了前列腺癌LNCaP、DU145、22RV1以及PC3细胞系的Periostin的蛋白和mRNA表达情况。然后我们以表达Periostin的LNCap细胞为研究对象进行RNA干扰研究。将LNCap细胞分为3组：正常LNCap细胞、GFP-LNCap细胞和shRNA-Periostin-LNCap细胞。荧光显微镜下观察shRNA-Periostin慢病毒感染LNCaP细胞后的感染效率,Real-Time PCR以及Western-blot法检测（?）shRNA-Periostin慢病毒感染LNCaP细胞后的Periostin的mRNA和蛋白的表达情况。此外,我们分别应用MTT、流式细胞仪以及Transwell小室法检测了RNA干扰Periostin后LNCap细胞的生长能力、凋亡情况以及侵袭能力。我们进一步构建了前列腺癌裸鼠皮下移植瘤模型并分3组：正常LNCap细胞组、GFP-LNCap细胞组和shRNA-Periostin-LNCap细胞组。观察了RNA干扰Periostin对LNCaP细胞体内成瘤的影响,并通过对瘤体组织进行CD31的免疫组化染色观察了各组移植瘤的肿瘤血管密度（MVD）。结果：Western-blot结果显示Periostin在前列腺癌组织中表达明显增强,免疫组化结果进一步提示前列腺癌上皮细胞与良性前列腺增生上皮细胞Periostin的表达无显著差异（P>0.05）,而相对于良性前列腺增生组织,前列腺癌基质中Periostin明显高表达（P<0.01）。免疫荧光以及Western-blot结果显示Periostin仅在前列腺癌LNCap细胞中表达,而且Periostin蛋白在前列腺癌不同细胞系表达的差异与其转录水平明显相关,RT-PCR结果提示Periostin mRNA也仅仅在LNCap细胞中表达。随后的RNA干扰研究显示LNCap细胞感染shRNA-Periostin慢病毒48h后荧光显微镜下观察,感染效率达到90%以上。正如我们期望的结果,shRNA-Periostin LNCap细胞的Periostin mRNA和蛋白表达水平明显下调。MTT结果显示相对于正常LNCap细胞、GFP-LNCap细胞,从第3天起,shRNA-Periostin-LNCap细胞生长开始受到明显抑制,在第6天差异最明显（P<0.01）。流式细胞检测结果显示,shRNA-Periostin-LNCap细胞的凋亡率为18.1%,明显升高（P<0.05）,而正常LNCap细胞、GFP-LNCap细胞的凋亡率分别为4.4%和4.9%,无明显差异（P>0.05）。Transwell小室法显示正常LNCap细胞和GFP-LNCap细胞穿膜细胞数分别为37.38±5.53,35.38±6.57,此两组无统计学差异（P>0.05）。相比前两者,shRNA-Periostin-LNCap细胞穿膜细胞数为20.25±6.71,明显抑制（?）LNCap细胞的体外侵袭（P<0.05）。前列腺癌裸鼠皮下移植瘤模型结果显示与体夕（?）shRNA-Periostin-LNCap细胞生长受到抑制相似,shRNA-Periostin-LNCap细胞组的体内移植瘤的生长也明显受到抑制,shRNA-Periostin-LNCap细胞组的体内移植瘤的重量也明显低于正常LNCap细胞组和GFP-LNCap细胞组。三组裸鼠皮下移植瘤组织CD31免疫组化染色结果显示正常LNCap细胞组的MVD为32.1±9.4,GFP-LNCap细胞组的MVD为30.2±11.5,而shRNA-Periostin-LNCap细胞组MVD为15.5±5.6,相比其余两组肿瘤血管明显减少（P<0.05）。结论：Periostin在前列腺癌基质中高表达而且Periostin仅在前列腺癌LNCap细胞系中表达。通过RNA干扰沉默Periostin在LNCap细胞中的表达不仅抑制了LNCap细胞在体外的生长和侵袭,并且能够促进LNCap细胞凋亡。RNA干扰沉默Periostin的表达抑制了LNCap细胞的体内成瘤可能与抑制肿瘤血管的生成有关。因此,Periostin极有可能成为前列腺癌的一个有价值的生物标记物和一个新的干预靶点。