利用代谢工程手段改善乳酸乳球菌胁迫抗性的研究

论文摘要

乳酸乳球菌是乳制品发酵工业中重要的发酵剂,也是最为常用的诱导表达型宿主菌,具有重要的经济价值,是颇受关注的一种乳酸菌。然而,由酸胁迫导致的较低生物量和由氧胁迫导致的对生产条件的较高要求,是乳酸乳球菌在食品工业和代谢工程应用中主要的不利因素。如果能在深入理解胁迫抵抗机制的基础上,找到提高乳酸乳球菌胁迫抗性的途径,实现粗放生产条件下浓缩型发酵剂的生产和“细胞加工厂”的高密度培养,将会极大地推动乳酸乳球菌在工业生产中的应用。但是,迄今为止,国外有关提高乳酸乳球菌酸胁迫和氧胁迫抗性的报道寥寥无几,而在国内与乳酸乳球菌胁迫相关的研究仍属于空白。本论文以不能生物合成谷胱甘肽（GSH）也不能从外源吸收GSH的乳酸乳球菌乳脂亚种NZ9000和不能生物合成GSH但能够从外源吸收GSH的乳酸乳球菌乳脂亚种SK11为实验菌株,以提高乳酸乳球菌好氧生长性能为目标,利用代谢工程手段在乳酸乳球菌NZ9000中生产来源于茂原链轮丝菌的谷氨酰胺转胺酶（MTG）;在乳酸乳球菌SK11中生产GSH来改善乳酸乳球菌菌株对酸胁迫和氧胁迫的抗性,并对其机理进行深入探讨。主要研究结果如下∶1.通过构建能够在胞内活性表达MTG编码基因mtg的乳酸乳球菌NZ9000（pFL010）,发现在乳酸乳球菌NZ9000中生产MTG可以显著改善宿主菌的好氧生长性能。在控制pH为6.5±0.1的条件下,乳酸乳球菌NZ9000（pFL010）在CM培养基（不含pH缓冲剂）中好氧生长的最高生物量为4.73 g·L-1,是对照菌乳酸乳球菌NZ9000（pNZ8148）的1.8倍;并且,乳酸乳球菌NZ9000（pFL010）的细胞对葡萄糖平均得率（Yx/s）最高为71.1 g·mol-1,是乳酸乳球菌NZ9000（pNZ8148）的2.6倍。在不控制pH的条件下,乳酸乳球菌NZ9000（pFL010）在CM培养基中好氧生长的最高生物量为4.13 g·L-1,是乳酸乳球菌NZ9000（pNZ8148）的12.1倍;并且,乳酸乳球菌NZ9000（pFL010）的最高Yx/s为72.9 g·mol-1,是乳酸乳球菌NZ9000（pNZ8148）的5.4倍。2.分析了mtg基因的本底表达对乳酸乳球菌NZ9000生理产生的影响。首先,乳酸乳球菌NZ9000（pFL010）细胞壁明显增厚,阻碍了基因表达诱导物乳酸链球菌素（nisin）诱导信号的传递,因而nisin对乳酸乳球菌NZ9000（pFL010）中mtg基因无诱导表达作用,并且乳酸乳球菌NZ9000（pFL010）具有了对高浓度nisin（500μg·mL-1）的抗性。其次,乳酸乳球菌NZ9000（pFL010）的胞内pH（pHin）升高,使其胞内乳酸脱氢酶（LDH）活性降低,NADH氧化酶活性升高。由于NADH的高效氧化致使LDH途径丧失,造成乳酸乳球菌NZ9000（pFL010）发酵液中乳酸含量低于检测限。并且,代谢产物的分析表明MTG的活性导致丙酮酸节点的代谢流向发生了显著的改变。在乳酸乳球菌NZ9000（pFL010）发酵液中,源自丙酮酸的主要代谢产物（乳酸,乙酸,乙醇,3-羟基-2-丁酮,双乙酰和2,3-丁二醇）的浓度均有不同程度

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.2 国内外研究动态
• 1.3 本论文的主要研究内容
• 参考文献
• 第二章 在乳酸乳球菌NZ9000 中生产外源谷氨酰胺转胺酶显著改善宿主菌好氧生长性能
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 参考文献
• 第四章 谷胱甘肽保护乳酸乳球菌NZ9000 抵抗氧胁迫
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 参考文献
• 第五章 谷胱甘肽保护乳酸乳球菌SK11 抵抗氧胁迫和酸胁迫
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.3 结果
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 参考文献
• 第六章 一株具有谷胱甘肽合成能力的乳酸乳球菌的分离与初步研究
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.3 结果
• 6.4 讨论
• 6.5 本章小结
• 参考文献
• 结论
• 论文创新点
• 攻读博士学位期间论文发表与写作情况
• 致 谢
• 附录 英文缩写与中文名称对照