厌氧菌群发酵制氢的定向强化及其机制解析

论文摘要

混合菌群发酵制氢具有较好的工业化应用前景，是生物质能源研究的热点之一。但是从生理生化角度出发，混合菌群中微生物多样性导致的内源异质性会在产氢过程中形成“短板效应”，从而影响菌群整体水平的发酵性能，而这种效应在高有机负荷转化条件下表现得更为明显。因此如何有效约束和调控厌氧产氢菌群的内源异质性，强化菌群整体水平的发酵性能，实现高浓度底物转化过程中的定向强化制氢，这对提高厌氧发酵制氢的生物质能源转化效率起到非常重要的促进作用。本论文以厌氧污泥为研究体系，采用复合选择性压力和级联进化策略对厌氧产氢菌群进行适应性进化，通过改造微生物群落结构和提高功能微生物的生长发酵性能，约束和调控产氢菌群中微生物的异质性，实现在高有机负荷转化条件下的定向强化发酵制氢；在此基础上，论文借助DGGE、qPCR等多种技术手段对整个厌氧污泥体系多维水平的进化机制进行解析。主要研究结果如下：（1）有机酸胁迫对产氢活性的抑制效应比对菌群代谢活性的抑制效应更为严重，且丁酸胁迫对厌氧发酵制氢的抑制效应比乙酸胁迫更显著。三种代谢抑制剂（氯仿、4-甲基吡唑和草氨酸盐）的复合作用可以有效约束产氢菌群的代谢异质性并促进产氢。在添加0.1%氯仿、8mM4-甲基吡唑和15mM草氨酸盐的发酵体系中，氢气产率达到了2.30mol/mol，而对照体系的氢气产率仅为1.48mol/mol。以三种代谢抑制剂和丁酸胁迫作为复合选择性压力，采用分批模式的适应性进化策略可以一定程度提高产氢菌群对丁酸胁迫的耐受力以及强化其定向发酵制氢能力。进化菌群和出发菌群在不含胁迫条件下的氢气产率分别为2.06mol/mol和1.48mol/mol，底物降解率都在99%以上；在250mM丁酸胁迫条件下，出发菌群的底物降解率和氢气产率分别只有58.6%和0.42mol/mol，而进化菌群则达到了98%和1.67mol/mol。进一步考察进化菌群的发酵表现，结果发现分批模式适应性进化策略的不稳定性和局限性。（2）基于连续流模式的级联适应性进化策略可以有效抑制产氢菌群的代谢异质性，赋予进化菌群稳定的定向强化发酵制氢能力。考察级联适应性进化不同阶段产氢菌群的发酵性能及其稳定性，结果显示各阶段菌群的发酵制氢能力有明显差异。出发菌群的氢气产率为1.47mol/mol，氯仿驯化过的产氢菌群则为1.63mol/mol。酸适应性进化后的产氢菌群发酵体系中，氢气产率上升至1.96mol/mol，而乙醇、丁醇和乳酸的产率分别只有0.05、0.01和0.03mol/mol。在复合选择性压力下获得的进化菌群发酵体系中，其氢气、乙酸和丁酸的产率分别达到2.19、0.58和0.55mol/mol，而乙醇和乳酸的产率则分别为0.02和0.01mol/mol。研究酶学耐酸机制（acid tolerance response, ATR）与发酵动力学参数之间的相互关系发现，hydrogenase和H+-ATPase的比酶活与比产氢速率和比产酸速率之间有着相似的变化规律，而且产氢菌群对自生胁迫压力展现出某种“预测”效应，在进化菌群中这种效应更加明显。针对谷氨酸脱羧酶系统（glutamic acid decarboxylase,GAD）的效能分析发现，外源谷氨酸的添加对产氢菌群的氢气产率并没有显著影响，但是促进了氢气的生产强度。（3）进化菌群在不同有机负荷下的发酵表现比出发菌群更为稳定，进一步考察两者的代谢变化规律发现，它们在各自的代谢变化区域范围内展现出不同的代谢特征，这表明两者的生化性质存在明显差异。分析两者在相关代谢酶学水平的差异，结果表明，相比于出发菌群，进化菌群中产醇途径相关酶的比活性相对较低，而定向发酵制氢途径相关酶的比活性相对较高；考察pH和丁酸胁迫对相关酶活的影响，结果表明，进化菌群中定向发酵制氢相关途径的代谢酶和H+-ATPase对pH和丁酸浓度变化的稳定性更好，从而间接反映了两种菌群在酶学水平上的异质性差异。（4）在不同有机负荷下，对出发菌群和进化菌群微生物群落结构和hydA表达水平的差异进行了探讨。聚类分析表明，随着有机负荷的逐渐提高，进化菌群的微生物群落结构比出发菌群的稳定性好。基于DGGE指纹图谱的多样性指数计算表明，进化菌群的种群丰富度指数明显低于出发菌群，而且其种群结构的均匀度明显好于出发菌群，从而进一步量化两者在微生物群落结构水平的异质性差异。DGGE片段克隆测序结果表明，出发菌群和进化菌群的优势微生物群落发生了明显的演替；同时荧光定量PCR结果显示，两种菌群的hydA在DNA水平上的数量差异不大，但是进化菌群的hydA表达水平要明显高于出发菌群。（5）随着有机负荷的逐渐提高，出发菌群和进化菌群中ATP含量、NADH+NAD+总量以及AcetylCoA/CoA的比值变化没有发生明显变化，且进化菌群ATP含量略高。但是有机负荷增加会提高菌群内部的ButyrylCoA/CoA比值和NADH/NAD+比值，出发菌群的NADH/NAD+比值增加更为明显，而进化菌群的ButyrylCoA/CoA比值增加更为显著。电子转移途径相关酶学研究发现，随着有机负荷的增加，NADH-ferredoxin reductase比活性显著增加，且进化菌群的变化趋势更为明显；此外出发菌群的Ferredoxin-NAD+reductase比活性会明显上升，而进化菌群则表现得相对稳定。

论文目录

摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 概述

1.1.1 生物制氢技术

1.1.2 定向强化发酵制氢的实质与意义

1.1.3 混合菌群的异质性对定向强化发酵制氢的影响

1.1.4 适应性进化策略在混合菌群性能强化中的应用前景

1.2 国内外研究进展

1.2.1 厌氧发酵产氢微生物

1.2.2 混合菌群的发酵制氢

1.2.3 氢化酶的生理学意义

1.2.4 发酵产氢菌群中代谢表现的异质性

1.2.5 发酵产氢菌的生理压力及耐受响应异质性

1.2.6 Clostridium sp.发酵产氢菌的有机酸排泄及耐酸响应机制

1.2.7 分子生态学技术在发酵制氢中的应用

1.3 本论文主要研究内容

1.3.1 立题依据和研究意义

1.3.2 本论文主要研究内容

第二章适应性进化因子的选择及其效能分析

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 接种物来源及预处理

2.2.2 培养基成分

2.2.3 试剂和仪器

2.2.4 厌氧发酵制氢系统的启动

2.2.5 有机酸胁迫效应分析

2.2.6 代谢途径抑制剂的效能分析

2.2.7 基于分批发酵模式的适应性进化

2.2.8 适应性进化的效能及其稳定性分析

2.2.9 分析测定方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 有机酸胁迫对发酵制氢的抑制效应

2.3.2 同型产乙酸抑制剂对产氢产酸的影响

2.3.3 醇脱氢酶抑制剂对产氢产酸的影响

2.3.4 乳酸脱氢酶抑制剂对产氢产酸的影响

2.3.5 代谢抑制剂对产氢动力学的影响

2.3.6 基于分批发酵模式的适应性进化

2.4 本章小结

第三章基于连续流模式的产氢菌群适应性进化策略

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 接种物

3.2.2 培养基成分及发酵条件

3.2.3 试剂和仪器

3.2.4 产氢菌群在连续流中的级联适应性进化

3.2.5 适应性进化不同阶段产氢菌群的发酵性能对比

3.2.6 同型产乙酸菌的定量

3.2.7 PCR-DGGE 分析

3.2.8 H+-ATPase 活性的测定

3.2.9 谷氨酸脱羧酶（GAD）活性测定

3.2.10 氢化酶（hydrogenase）活性测定

3.2.11 分析测定及数据处理方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 同型产乙酸菌的在连续流中的消逝

3.3.2 基于复合选择性压力的级联适应性进化

3.3.3 适应性进化不同阶段产氢菌群的发酵性能及其稳定性

3.3.4 定向发酵制氢能力的强化与酶学 ATR 机制之间的相互关系

3.3.5 谷氨酸对发酵制氢的影响

3.4 本章小结

第四章出发菌群和进化菌群在酶学水平上的差异解析

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 接种物

4.2.2 培养基及培养条件

4.2.3 试剂与仪器

4.2.4 关键代谢途径的酶学表征

4.2.5 产氢菌群中的相关酶活对 pH 的响应

4.2.6 产氢菌群中的相关酶活对丁酸胁迫的响应

4.3 结果与讨论

4.3.1 进化菌群和出发菌群的代谢规律比较

4.3.2 出发菌群中相关代谢途径的酶活变化规律

4.3.3 进化菌群中相关代谢途径的酶活变化规律

4.3.4 产酸途径的相关酶活对 pH 变化的稳定性差异

4.3.5 PTB 和 BK 对丁酸反馈抑制的稳定性差异

4.3.6 酶学 ATR 机制对 pH 和丁酸浓度变化的稳定性差异

4.4 本章小结

第五章微生物群落结构和 hydA 表达水平的差异解析

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 样品来源

5.2.2 试剂和仪器

5.2.3 DNA 提取和引物合成

5.2.4 污泥样品的 RNA 提取

5.2.5 RNA 样品中 DNA 污染的去除

5.2.6 hydA 定量 PCR 标准品构建

5.2.7 hydA DNA 水平的定量

5.2.8 hydA mRNA 水平的定量

5.2.9 PCR-DGGE 分析

5.2.10 DGGE 图谱统计分析

5.3 结果与讨论

5.3.1 进化菌群和出发菌群微生物群落结构稳定性差异分析

5.3.2 基于 DGGE 指纹图谱的进化菌群和出发菌群多样性差异分析

5.3.3 进化菌群和出发菌群内部优势微生物种群的定性

5.3.4 进化菌群和出发菌群的 hydA 在 DNA 水平的数量差异

5.3.5 进化菌群和出发菌群的 hydA 在转录水平的差异

5.4 本章小结

第六章出发菌群和进化菌群在辅因子水平上的差异解析

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.2.1 样品来源

6.2.2 试剂和仪器

6.2.3 ATP 测定方法

6.2.4 NAD+/NADH 测定方法

6.2.5 丁酰辅酶 A/乙酸辅酶 A/辅酶 A 测定方法

6.2.6 相关酶活测定方法

6.3 结果与讨论

6.3.1 进化菌群和出发菌群中 ATP 含量的变化规律

6.3.2 出发菌群和进化菌群 NADH/NAD+的变化规律

6.3.3 进化菌群和出发菌群中辅酶 A 库的变化规律

6.3.4 电子转移相关酶学机制的差异解析

6.4 本章小结

主要结论与展望

主要结论

展望

论文创新点

致谢

参考文献

附录

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