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促红细胞生成素对Aβ25-35致PC12细胞损伤的保护作用及机制研究

2020-12-07阅读(775)

促红细胞生成素对Aβ25-35致PC12细胞损伤的保护作用及机制研究

论文摘要

第一部分促红细胞生成素对Aβ25-35致PC12细胞损伤的保护作用目的：Aβ25-35处理PC12细胞制备AD细胞模型，观察EPO对Aβ25-35所致PC12细胞损伤的保护作用，并探讨其相关机制。方法：采用MTT比色法检测细胞存活率；Hoechst33342荧光染色法及TUNEL法观察凋亡细胞形态的改变；AnnexinV-PI双染色检测细胞凋亡率；分子探针DCFH-DA检测细胞内活性氧的水平；罗丹明123标记线粒体荧光分光光度计检测线粒体膜电位水平；Western Blot检测PC12细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表达。结果：（1）不同浓度的Aβ25-35对PC12细胞的生长产生明显抑制作用，且随着Aβ25-35浓度的增加，细胞活力受到抑制的程度也逐渐增加。当Aβ25-35浓度为20μmol/L时，PC12细胞存活率仅为对照组的62．6％。与对照组比较有极显著差异。（2）2U/mlEPO可明显减轻20μmol/L Aβ25-35对PC12细胞存活率的抑制，细胞存活率为96．7±10．7％。（3）在TUNEL法和Hochest荧光染色法实验中，从形态学上观察EPO对Aβ25-35致PC12细胞凋亡的保护作用，Annexin V-PI标记的流式细胞仪分析亦对EPO的抗凋亡作用进行了定量检测，以上实验结果均显示：20μmol/LAβ25-35导致PC12细胞凋亡，给予2U/ml EPO预处理1h可使PC12细胞的凋亡百分率显著降低。（4）20μmol/LAβ25-35导致PC12细胞ROS含量增加，线粒体膜电位耗散，Bcl-2/Bax比值降低及caspase-3活性增强；EPO可以抑制Aβ25-35导致的以上变化。结论：Aβ25-35对PC12细胞具有氧化损伤及诱导凋亡的作用。本实验证实EPO通过抗氧化、抗凋亡机制对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤发挥保护效应。第二部分JAK2/STAT5信号通路在EPO抗Aβ25-35致PC12细胞损伤中的作用目的：探讨JAK2/STAT5信号转导通路在EPO对Aβ25-35致PC12细胞损伤的保护中的作用。方法：（1）2U/mlEPO和20μmol/L的Aβ25-35共孵育后15min、30mim及60min收集细胞。采用Western Blot方法检测JAK2、p-JAK2、STAT5及P-STAT5蛋白的表达；（2）在EPO处理前给予该通路的特异性抑制剂AG490，采用Western Blot方法检测JAK2、p-JAK2、STAT5及P-STAT5蛋白的表达；MTT法检测细胞存活率；TUNEL和Hoechst33342荧光染色法观察细胞凋亡的改变。结果：（1）EPO可快速激活JAK2蛋白和STAT5蛋白，其中p-JAK2在15min表达最明显，60min内还可见持续表达，组间蛋白表达量有显著性差异，而p-STAT5于15min时表达增加，30min达峰值，60min仍持续表达。（2）在EPO处理前给予该通路的特异性抑制剂AG490能有效阻断EPO诱导的JAK2的活化及STAT5的酪氨酸磷酸化。AG490还可拮抗EPO的细胞保护作用，使PC12细胞存活率降低，凋亡细胞数量增加。结论：JAK2/STAT5信号转导通路参与了EPO对Aβ25-35致PC12细胞损伤的保护作用。第三部分PI3K/Akt信号通路在EPO抗Aβ25-35诱导PC12细胞损伤中的作用目的：Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡制备AD细胞模型，探讨PI3K/Akt信号通路在EPO抗Aβ25-35诱导PC12细胞损伤中的作用。方法：采用Western Blot方法检测Akt、p-Akt、GSK-3β、P-GSK-3β及Bcl-2蛋白的表达；MTT法检测细胞存活率；TUNEL法和Hoechst33342荧光染色法观察细胞凋亡的形态学改变。结果：（1）2U/mlEPO与20μmol/LAβ25-35共孵育时，p-Akt表达水平呈时间依赖性升高。EPO+Aβ组与对照组比较有显著性差异。给予PI3K抑制剂LY294002后p-Akt表达水平显著降低。此外，MTT法检测细胞存活率实验发现：在给予PI3K抑制剂LY294002的情况下，EPO对PC12细胞的保护作用被明显抑制，TUNEL和Hoechst实验也显示，LY294002可使EPO+Aβ25-35组的细胞凋亡率显著升高。（2）EPO使Akt下游靶蛋白GSK-3β磷酸化而失活，即p-GSK-3β表达增加，以及EPO使Akt的另一靶蛋白Bcl-2的表达增加。PI3K抑制剂LY294002可对抗EPO所产生的效应。结论：EPO激活PI3K/Akt信号通路后，一方面使GSK-3β磷酸化而失活，另一方面上调Bcl-2的表达水平，两者共同参与EPO对Aβ25-35所致的PC12细胞损伤的保护作用。

论文目录

  • 一、缩略词表
  • 二、前言
  • 参考文献
  • 三、摘要
  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 四、正文
  • 25-35致PC12细胞损伤的保护作用'>第一部分 促红细胞生成素对Aβ25-35致PC12细胞损伤的保护作用
  • 1 材料与方法
  • 2 统计学处理
  • 3 结果
  • 4 讨论
  • 参考文献
  • 25-35致PC12细胞损伤中的作用'>第二部分 JAK2/STAT5信号通路在EPO抗Aβ25-35致PC12细胞损伤中的作用
  • 1 材料与方法
  • 2 统计学处理
  • 3 结果
  • 4 讨论
  • 参考文献
  • 25-35诱导PC12细胞损伤中的作用'>第三部分 PI3K/Akt信号通路在EPO抗Aβ25-35诱导PC12细胞损伤中的作用
  • 1 材料与方法
  • 2 统计学处理
  • 3 结果
  • 4 讨论
  • 参考文献
  • 五、综述
  • 参考文献
  • 六、全文总结
  • 七、攻读博士学位期间发表论文目录
  • 八、致谢

    • 相关论文文献

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