低分子肝素对人乳腺癌细胞MCF-7的体外作用及其机制研究

论文摘要

目的:通过研究低分子肝素（low molecular weight heparin,LMWH）对人乳腺癌细胞MCF-7的体外作用,观察低分子肝素对MCF-7细胞体外作用的影响,进一步阐明低分子肝素抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡以及抑制肿瘤细胞侵袭的可能机制,并探讨其用于乳腺癌治疗及化学预防的可行性。方法:1体外培养人乳腺癌细胞MCF-7,采用四甲基偶氮唑蓝（tetrzolium-based colorimetric assay,MTT）比色法检测低分子肝素对该细胞增殖的影响;应用普通光学显微镜和透射电子显微镜观察细胞的形态学变化;应用流式细胞仪分析低分子肝素对MCF-7细胞周期分布和凋亡的诱导作用;流式细胞仪测定低分子肝素处理细胞48h后p53、Bax的蛋白水平。采用逆转录-聚合酶链反应（revers transcription PCR,RT-PCR）半定量检测低分子肝素处理细胞48h后p53、Bax mRNA的表达水平。2采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测低分子肝素对人乳腺癌细胞MCF-7黏附的影响,采用Transwell小室法检测低分子肝素对该细胞的迁移、侵袭的抑制作用,采用RT-PCR法半定量检测低分子肝素处理细胞24h后TF mRNA的表达水平。结果:1 MTT比色法显示低分子肝素（25、50、100IU /ml）对MCF-7细胞增殖具有抑制作用。不同浓度低分子肝素处理细胞4872h后,与对照组相比,各处理组OD值均有不同程度下降,具有极显著性差异（P<0.01）。各处理组间比较,亦具有极显著性差异（P<0.01）。且随低分子肝素处理浓度的增大、作用时间的延长,OD值逐渐下降,即低分子肝素对MCF-7细胞的增殖抑制作用呈明显的剂量-效应和时间-效应依赖关系。25、50、100IU /ml低分子肝素作用MCF-7细胞48h后,光镜下观察细胞形态结果显示:未经药物作用的细胞呈菱形或多形性,形态饱满,低分子肝素作用MCF-7细胞48h后细胞出现皱缩,破裂,变圆,有的细胞两端出现细长的伪足,细胞胞浆中出现空泡,脱落细胞增多。随药物浓度增大和作用时间延长,培养基中见到大量细胞碎片。在透射电镜下观察,正常MCF-7细胞形态较大,呈圆形,胞膜完整,表面有大量绒毛样突起。细胞核大,形态不规则,有13个核仁,内染色质丰富,无明显染色质边集。细胞质内细胞器丰富,可见内质网、线粒体、溶酶体等细胞器;100IU/ml低分子肝素作用48h后的MCF-7细胞呈现不同程度凋亡性变:细胞体积缩小,微绒毛减少,胞质浓缩,胞浆中出现较多空泡,胞核局部向外呈锐角突起,核染色质高度浓缩,电子密度增高,边集于核膜下,形成沿核膜收缩的新月状体。线粒体部分脊和膜融合消失,粗面内质网有脱颗粒现象。流式细胞仪检测细胞周期分布显示25、50、100IU /ml低分子肝素作用MCF-7细胞48h后,随药物浓度增大,G0/G1期细胞逐渐增多,S期细胞逐渐减少。即低分子肝素可阻滞MCF-7细胞周期进程于G0/G1期,具有极显著性差异（P<0.01）,该作用呈剂量-效应依赖关系。流式细胞仪可测得典型的亚二倍体凋亡峰。凋亡百分率随低分子肝素浓度增大和作用时间延长而逐渐升高。25、50、100IU /ml低分子肝素作用细胞48h后凋亡百分率分别为11.6%、23.5%、30.83%。流式细胞仪测定低分子肝素处理细胞48h后p53、Bax的蛋白水平;RT-PCR分析细胞p53、Bax mRNA表达水平;结果显示:25、50、100IU /ml低分子肝素作用MCF-7细胞48h后,p53、Bax蛋白水平及mRNA的表达水平随处理浓度增大而逐渐增强。差异均具有极显著性（P<0.01）。2 MTT比色法分析检测低分子肝素对人乳腺癌MCF-7细胞黏附的影响,结果显示:不同浓度低分子肝素处理细胞60120min后,与对照组相比,各处理组OD值均有不同程度下降,具有显著性差异（P<0.05）。且随低分子肝素处理浓度的增大OD值逐渐下降,即低分子肝素对MCF-7细胞与细胞外基质成分Matrigel粘附力的抑制作用呈明显的剂量-效应依赖关系。迁移和侵袭实验显示:MCF-7细胞处理组（25、50、100IU /ml低分子肝素作用24h）较对照组穿膜细胞数显著减少,均有极显著性差异（P<0.01）;其迁移抑制率和侵袭抑制率均随低分子肝素浓度增大而显著升高。低分子肝素对MCF-7细胞的迁移和侵袭抑制均具呈明显的剂量-效应依赖关系。半定量RT-PCR检测结果显示:低分子肝素处理后MCF-7细胞TF mRNA表达水平与对照组相比明显降低。结论:1低分子肝素具有抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖及诱导其凋亡的作用,为临床乳腺癌的治疗和化学预防提供了实验依据。2低分子肝素抑制结人乳腺癌细胞MCF-7增殖的作用呈时间-剂量依赖关系。3低分子肝素阻滞人乳腺癌细胞MCF-7于G0/G1期并可诱导该细胞凋亡。4低分子肝素可通过上调p53、Bax mRNA和蛋白表达水平而发挥其抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖、诱导该细胞凋亡的作用。5低分子肝素可通过下调TF mRNA表达水平抑制人乳腺癌细胞MCF-7黏附、迁移、侵袭。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 低分子肝素对人乳腺癌细胞MCF-7 的体外作用及其机制研究
• 引言
• 第一部分 低分子肝素对人乳腺癌细胞MCF-7 增殖抑制实验
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 低分子肝素对人乳腺癌细胞MCF-7 侵袭抑制实验
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述 组织因子与肿瘤
• 致谢
• 个人简历