FoxO3a及其信号转导通路在糖尿病性心肌病发病机制中的作用

论文摘要

背景心血管疾病是糖尿病患者的主要死亡原因,在西方国家约70%的糖尿病患者死于糖尿病性心血管疾病。自1972年Rubler等首次提出糖尿病性心肌病（Diabetic Cardiomyopathy,DCM）概念以来,流行病学、病理学以及实验研究的结果均提示糖尿病性心肌病变的存在。糖尿病性心肌病变与糖尿病特有的代谢异常有关。其临床特征早期以心脏舒张功能不全、晚期以收缩功能不全为主,容易发生充血性心力衰竭。近年来国内外学者对DCM进行了大量的基础和临床研究,取得了阶段性的成果。但DCM的发病机制、早期诊断和治疗,仍处在研究探索中。深入研究DCM的发病机制,阻断DCM的发病途径对DCM的防治具有重要意义。DCM发生受多种因素影响。心肌细胞代谢紊乱、微血管病变和氧化应激被认为是其发生和发展的可能机制。研究表明,DCM早期就可以出现心肌细胞的凋亡和坏死。高血糖时氧化应激增加,信号转导途径改变,引起异常基因表达,激活细胞程序化死亡。心肌细胞凋亡的信号转导机制可能是:①通过死亡受体转导通路介导心肌细胞凋亡;②丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）转导通路;③磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信号转导通路。DCM病理表现为心肌肥厚和心肌纤维化等。心肌成纤维细胞增生和其合成分泌胶原量及种类的变化,即心肌间质重构。心肌细胞的凋亡和心肌纤维化在DCM的发生发展中起重要作用。FoxO（Forkhead box O transcription factors）蛋白家族是2000年才正式发布统一命名的蛋白质家族,共可以分为17个亚家族,其分别被命名为FoxA～Q,在这17个亚家族中,Fox0亚家族主要通过转录调控信号传导途径在动物的生长发育、细胞分化、代谢、凋亡和免疫等方面起重要作用。依据DNA结合结构域之外氨基酸序列的相似性,脊椎动物的Fox0亚家族成员又可进一步分为Fox01、Fox03和Fox04。Fox0被生长因子激活的PI3K通路激活,产生Akt依赖磷酸化作用,磷酸化的Fox0激活或抑制细胞凋亡或细胞分裂周期相关的基因如:Bim、P27kipl、FasL、Bcl26、TRA IL、FLIP、MnS0D、GADD45（Za）,进而促进或抑制凋亡。研究表明,很有可能Fox0因子依赖于细胞类型而激活不同的基因,Fox0可能依赖于适当的辅助因子而对细胞起不同的作用,或者引起凋亡,或者不引起凋亡,或仅在应激条件下诱导凋亡,从而引起不同的效应。不同的研究对Fox0所诱导的凋亡基因表达的结果是有差别的,Fox0影响凋亡的机制目前尚远未清晰。文献提示Fox0转录因子对细胞及细胞外基质的病理生理学变化有转录调节作用。国外已有学者证实Fox03a转录因子在内皮细胞中通过PI3K/Akt/Fox03a途径调节内皮细胞凋亡。Fox03a转录因子是否参与了心肌细胞的凋亡国内外尚未见报道。研究表明,糖尿病目前的治疗,包括血糖的控制,可以延缓疾病的发展,但仅仅控制血糖并不能充分减少糖尿病患者的心血管事件的发生和进程。因此探讨该疾病发生和发展的潜在机制,寻找糖尿病性心肌病防治的新靶点已成为减少糖尿病性心肌病病死率方面的亟待解决的问题。他汀类（Statins）药物是细胞内源性胆固醇合成的限速酶—羟甲基戊二酸单酰辅A（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzymeA,HMG-CoA）还原酶的抑制剂,能有效抑制胆固醇的合成,临床已普遍用于治疗高脂血症。近年来有研究报道他汀类药物对内皮细胞有抑制凋亡作用,但其作用机制尚不完全清楚。Carmen Urbich等证实阿托伐他汀和美伐他汀可通过抑制PI3K/Akt/Fox03a/Bim途径调节内皮细胞的凋亡。他汀类药物是否可通过抑制PI3K/Akt/Fox03a途径调节心肌细胞的凋亡、进而防治糖尿病性心肌病,目前国内外亦尚未见报道。本研究在分析糖尿病性心肌病细胞信号导途径的基础上,综合运用分子生物学、细胞生物学、组织病理学、超声心动图技术和计算机图像分析等方法,首次提出并探讨了PI3K/Akt/Fox03a信号传导途径在糖尿病性心肌病心肌细胞凋亡中的作用,进而应用HMG-CoA还原酶的抑制剂瑞舒伐他汀对糖尿病性心肌病模型动物进行了干预治疗,旨在探索糖尿病性心肌病药物防治的新靶点。目的（1）建立Wistar大鼠DCM动物模型;（2）观察DCM动物模型及瑞舒伐他汀干预组心肌组织病理学、超微结构和心脏形态结构的变化;（3）检测DCM动物模型及瑞舒伐他汀干预组心肌细胞的凋亡;（4）运用RT-PCR、Western-Blot、免疫组化等技术在大鼠DCM模型中验证PI3K/Akt/FoxO3a通路的存在,探讨该通路与心肌细胞凋亡的关系;（5）评价瑞舒伐他汀在防治DCM中的潜在作用。方法1.DCM动物模型的构建雄性Wistar大鼠（200～240g）46只,适应性喂养1周后,随机分为三组:正常对照组（n=10只）,DCM组（n=18只）,DCM+瑞舒伐他汀组（n=18只）。DCM组和DCM+瑞舒伐他汀组给予高糖、高热量饮食,4周后一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ,30mg/kg,溶解于10mM冷柠檬酸盐缓冲液中,PH值4.2）。正常对照组以标准大鼠饲料喂养,4周后腹腔注射同等剂量的柠檬酸盐缓冲液。注射STZ 72小时后取尾静脉血测血糖,糖尿病大鼠成模标准为:连续2次空腹血糖≥11.1mmol/L,未达成模标准者剔除。达成模标准者进入下一步实验,此后DCM+瑞舒伐他汀组大鼠每天以瑞舒伐他汀20mg/kg灌胃,DCM组和正常对照组大鼠以等量生理盐水灌胃,继续饲养20周。2.体重和血生化检查实验过程中,进行以下检测:（1）每隔1周称量体重1次,每隔2周检测空腹血糖1次。（2）分别于STZ注射前、STZ注射后1周、实验末抽血测定空腹血糖、空腹胰岛素、甘油三酯、胆固醇。3.超声心动图检测分别于糖尿病建模前、实验末进行常规超声心动图检查,测定如下指标:M型超声心动图测定左室收缩末期内径（LVIDs）、左室舒张末期内径（LVIDd）、射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）;彩色多普勒超声心动图观察瓣膜返流情况;脉冲波及连续波多普勒超声心动图测定二尖瓣口E波最大速度、A波最大速度、E/A比值、E波减速时间（EDT）、等容舒张时间（IVRT）、主动脉血流最大速度（APV）。根据心动周期,计算校正的EDT′(EDT′=EDT/（心动周期）1/2)及IVRT′(IVRT′=IVTR/（心动周期）1/2)。4.透射电镜观察超微结构的改变5.心肌组织病理学检查处死实验动物后,进行组织取材、固定、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片,常规HE染色和Masson三色染色,观察心肌细胞形态及胶原分布并拍片。6.采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡染成棕色的细胞核即为凋亡阳性细胞。计数方法:在×400物镜下计算阳性细胞数占细胞总数的比例,选择细胞总数200以上的视野,每个标本观察5张切片,取其平均值,从中计算阳性细胞率,取其平均值即凋亡指数（apoptosis index,AI）。7.实时定量RT-PCR法检测从心肌组织提取总RNA,经逆转录反应（RT）得到cDNA,以管家基因β-actin作为参照,通过实时定量RT-PCR技术分别检测三组PI3K、Akt、FoxO3a各因子的mRNA的表达。8.免疫组织化学法检测取组织切片,免疫组织化学法分别检测三组的PI3K、Akt、FoxO3a的蛋白表达。9.免疫印迹检测取心肌组织,提取总蛋白,经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离、转膜、蛋白印记、DAB显色等步骤,分别检测三组的PI3K、Akt、FoxO3a的蛋白表达。结果1.实验动物基本情况实验过程中,正常对照组大鼠精神状态良好,体重增加明显,反应敏捷,毛色白而光泽。DCM组和DCM+瑞舒伐他汀组大鼠出现多饮、多尿、多食和消瘦等症状,体重增加迟缓,精神萎靡,皮毛无光泽,视力下降等。整个实验过程中3只大鼠死亡,其中DCM组2只,DCM+瑞舒伐他汀组1只,死亡原因可能与糖尿病酮症酸中毒、感染或其他相关并发症有关。DCM+瑞舒伐他汀组有1只大鼠血糖未达成模标准,予以剔除。最终共42只完成实验,其中正常对照组10只,DCM组16只,DCM+瑞舒伐他汀组16只。2.体重与生化指标高糖高热量饮食喂养4周后,与正常对照组相比,DCM组和DCM+瑞舒伐他汀组大鼠体重、空腹胰岛素、甘油三酯和胆固醇水平较高（P＜0.05～0.01）,空腹血糖无明显差异（P＞0.05）。STZ注射后1周,与正常对照组相比,DCM组和DCM+瑞舒伐他汀组大鼠体重、空腹胰岛素水平无差异（P＞0.05）,空腹血糖、甘油三酯和胆固醇水平明显升高（P＜0.01）。实验末,与正常对照组相比,DCM组和DCM+瑞舒伐他汀组大鼠体重显著下降（P＜0.01）;空腹胰岛素水平降低（P＜0.05）,空腹血糖、甘油三酯水平明显升高（P＜0.01）,DCM组胆固醇水平明显升高（P＜0.01）,DCM+瑞舒伐他汀组组胆固醇水平无差异（P＞0.05）。3.超声心动图检测实验初,三组大鼠超声心动图检测各项指标（包括LVIDs、LVIDd、EF、FS、瓣膜返流、E波最大速度、A波最大速度、E/A比值、EDT′、IVRT′及APV）无显著性差异（P＞0.05）。实验末,DCM组和DCM+瑞舒伐他汀组比正常对照组大鼠LVIDs及LVIDd明显增加（P＜0.01）,房室瓣瓣膜返流发生率明显增加（P＜0.05）,E波最大速度下降,A波最大速度增快,E/A比值下降,IVRT′延长,FS降低,APV降低（P＜0.05）,EF降低（P＜0.01）,EDT′无显著性差异（P＞0.05）。实验末,DCM+瑞舒伐他汀组比DCM组大鼠LVIDs及LVIDd减小（P＜0.05）,房室瓣瓣膜返流发生率减少（P＜0.05）,E波最大速度增快,A波最大速度下降,E/A比值升高,IVRT′缩短,FS升高,APV增快（P＜0.05）,EF升高（P＜0.05）,EDT′无显著性差异（P＞0.05）。4.透射电镜观察超微结构的改变正常对照组心肌组织细胞排列整齐,心肌细胞质膜连续、完整;粗、细肌丝排列整齐,细胞间质可见成纤维细胞和少量胶原纤维;微血管管腔大小正常,内皮细胞结构正常。DCM组心肌组织细胞排列紊乱,质膜模糊、断裂;肌原纤维呈灶性溶解,肌丝扭曲、断裂,肌节对位不齐;间质可见大量胶原纤维分布;微血管管腔狭窄,内皮细胞肿胀明显,呈柱状向管腔突起。DCM+瑞舒伐他汀组较DCM组心肌组织细胞排列较整齐,心肌细胞质膜较规则,间质胶原纤维堆积明显减少。5.组织病理观察HE染色:正常对照组心肌细胞排列整齐,细胞核大小均一,胞浆染色均匀;DCM组心肌细胞排列紊乱,细胞核大小不甚规则,毛细血管基底膜的增厚,间质纤维化,心肌细胞肥大、坏死;DCM+瑞舒伐他汀组较DCM组显著改善。Masson三色染色:心肌细胞染色呈红色,间质胶原呈蓝绿色,红细胞呈橘黄色。正常对照组心肌细胞排列整齐,细胞核大小均一,胞浆染色均匀,心肌胶原组织分布均匀;DCM组心肌细胞排列紊乱,细胞核大小不甚规则,心肌内胶原组织明显增多,粗大胶原纤维相互连接成网状,排列紊乱,分布不匀,紧密围绕于心肌细胞周围及小血管周围;DCM+瑞舒伐他汀组较DCM组心肌细胞排列较整齐,细胞核大小较均一,胞浆染色较均匀,胶原纤维明显减少。6.采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡与正常对照组相比,DCM组和DCM+瑞舒伐他汀组心肌细胞凋亡指数（%）明显增加（P＜0.0001）。与DCM组比较,DCM+瑞舒伐他汀组的心肌细胞凋亡指数（%）明显降低（P＜0.01）。相关性分析显示DCM组空腹血糖与心肌细胞凋亡率呈明显的正相关（r=0.906,P＜0.0001）。7.RT—PCR检测PI3K、Akt、FoxO3a mRNA的表达水平与正常对照组相比,DCM组和DCM+瑞舒伐他汀组PI3K、Akt、FoxO3a mRNA表达水平明显升高（P＜0.05～0.01）。与DCM组相比,DCM+瑞舒伐他汀组PI3K、Akt、FoxO3a mRNA表达水平明显减低（P＜0.05）。相关性分析显示（1）DCM组空腹血糖与PI3K（r=0.396,P＜0.05）、Akt（r=0.534,P＜0.01）、FoxO3a（r=0.837,P＜0.001）mRNA表达水平呈明显的正相关。（2）DCM组心肌细胞凋亡率（%）与PI3K（r=0.48,P＜0.05）、Akt（r=0.593,P＜0.01）、FoxO3a（r=0.872,P＜0.001）mRNA表达水平呈明显的正相关。8.免疫组织化学染色分析PI3K、Akt、FoxO3a;染色阳性信号为棕色颗粒,主要定位于心肌细胞及内皮细胞。正常对照组心肌组织内可见少量、分布均匀、稀疏的浅棕色颗粒;DCM组心肌细胞胞浆内可见浓密的深棕色颗粒;DCM+瑞舒伐他汀组较DCM组明显稀疏,可见浅淡的棕色颗粒。9.各组大鼠PI3K/Akt/FoxO3a通路各关键分子蛋白质表达水平检测与正常对照组相比,DCM组和DCM+瑞舒伐他汀组PI3K、Akt、FoxO3a蛋白质表达水平明显升高（P＜0.05～0.01）。与DCM组相比,DCM+瑞舒伐他汀组PI3K、Akt、FoxO3a蛋白质表达水平明显减低（P＜0.05）。相关性分析显示（1）DCM组空腹血糖与PI3K（r=0.468,P＜0.01）、Akt（r=0.574,P＜0.01）、FoxO3a（r=0.731,P＜0.001）蛋白质表达水平呈明显的正相关。（2）DCM组心肌细胞凋亡率（%）与PI3K（r=0.571,P＜0.01）、Akt（r=0.645,P＜0.01）、FoxO3a（r=0.891,P＜0.001）蛋白质表达水平呈明显的正相关。结论1应用高热量饮食喂饲和小剂量STZ注射,成功建立了糖尿病性心肌病大鼠模型,为DCM发病机制的研究提供了可靠的平台;2心肌细胞凋亡,间质纤维化,是DCM的主要组织病理改变;3运用RT-PCR、Western-Blot、免疫组化等技术证实了在大鼠DCM模型中PI3K/Akt/FoxO3a通路的存在,并在心肌细胞的凋亡中起了重要作用;4瑞舒伐他汀可能通过影响PI3K/Akt/FoxO3a通路,抑制心肌细胞凋亡进而对DCM大鼠具有明显的保护效应。背景糖尿病性心肌病早期就可以出现心肌细胞的凋亡和坏死。这可能是由于高血糖时氧化应激增加,信号转导途径改变,引起异常基因表达,激活细胞程序化死亡。心肌细胞凋亡的信号转导机制可能是:①通过死亡受体转导通路介导心肌细胞凋亡;②丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）转导通路;③磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信号转导通路。FoxO在多种复杂疾病如:糖尿病、肿瘤中起重要的调节作用。FoxO被生长因子激活的PI3K通路激活,产生Akt依赖磷酸化作用,磷酸化的FoxO激活或抑制细胞凋亡或细胞分裂周期相关的基因如:Bim,P27kip1,FasL,Bcl26,TRA IL,FLIP,MnSOD,GADD45（Za）,或者促进凋亡,或者抑制凋亡。目前Carsten Skurk等证实在人脐静脉内皮细胞可通过激活PI3K/Akt/FoxO3a/FLIP途径导致Caspase8增多而促进凋亡。论文一在大鼠DCM模型中证实PI3K/Akt/FoxO3a通路的存在。本研究以Wistar大鼠乳鼠心肌细胞为实验对象,以不同浓度高糖为处理因素,观察高糖对心肌细胞FoxO3a表达及细胞凋亡的影响,进一步探讨其作用的分子机制,为DCM的防治提供实验与理论依据。目的1.观察高糖对心肌细胞凋亡的影响;2.探讨PI3K/Akt/FoxO3a信号转导通路在高糖对心肌细胞凋亡中的作用;3.探索PI3K/Akt/FoxO3a信号转导通路及其下游分子作用可能机制。方法1.心肌细胞分离及培养无菌条件下取出Wistar（2～3天）乳鼠心脏,剪碎、胰酶消化、差速贴壁,获取心肌细胞,生长至亚融合状态,取原代细胞进行实验。2.实验设计在体外模拟糖尿病状态,D-葡萄糖处理组:不同浓度（5、15、30 mmol/L）D-葡萄糖处理24小时对心肌细胞凋亡的影响;甘露醇对照组:甘露醇浓度（30 mmol/L）处理24小时对心肌细胞凋亡的影响。3.心肌细胞凋亡的检测应用流式细胞仪检测心肌细胞的细胞周期的变化及细胞凋亡率,应用Annexin V细胞凋亡试剂盒检测凋亡的阳性细胞。4.实时定量RT-PCR检测将所收集的细胞提取总RNA,经逆转录反应得到cDNA,以管家基因β-actin作为参照,通过RT-PCR技术检测指标基因PI3K、Akt、Foxo3a、FLIP、Bim、Caspase8、Caspase9等因子的mRNA表达水平。5.Western-Blot检测将所收集的细胞提取总蛋白,经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离、转膜、蛋白印记、DAB显色等步骤,检测PI3K、Akt、Foxo3a、FLIP、Bim、Caspase8、Caspase9各指标蛋白质表达水平。结果1.心肌细胞凋亡的检测不同浓度（5、15、30 mmol/L）D-葡萄糖刺激心肌细胞24h,细胞凋亡率（%）分别为1.38±0.32,8.41±0.99,13.12±1.14,与5mmol/L浓度组比较,15mmol/L,30mmol/L浓度组细胞凋亡率明显升高（P＜0.001～43.0001）;30 mmol/L（甘露醇mannitol）刺激心肌细胞24h,细胞凋亡率（%）为1.69±0.35,与5mmol/L浓度组比较,30 mmol/L（甘露醇）组细胞凋亡率无明显变化（P＞0.05）。相关性分析显示D-葡萄糖浓度与心肌细胞凋亡率呈明显的正相关（r=0.871,P＜0.01）。2.实时定量RT—PCR检测PI3K、Akt、FoxO3a、FLIP、Bim、Caspase8Caspase9等因子的mRNA表达水平与5mmol/L浓度组相比,15mmol/L,30mmol/L浓度组PI3K、Akt、FoxO3a、Bim、Caspase8、Caspase9 mRNA表达水平明显升高（P＜0.05～0.01）;FLIPmRNA表达水平降低（P＜0.05）。相关性分析显示（1）D-葡萄糖浓度与PI3K（r=0.578,P＜0.01）、Akt（r=0.369,P＜0.05）、FoxO3a（r=0.776,P＜0.01）、Bim（r=0.417,P＜0.05）、Caspase8（r=0.663,P＜0.01）、Caspase9（r=0.453,P＜0.05）mRNA表达水平呈明显的正相关;与FLIP mRNA表达呈负相关（r=-0.483,P＜0.05）。（2）心肌细胞凋亡率与PI3K（r=0.749,P＜0.01）、Akt（r=0.423,P＜0.05）、FoxO3a（r=0.822,P＜0.01）、Bim（r=0.521,P＜0.05）、Caspase8（r=0.698,P＜0.01）、Caspase9（r=0.506,P＜0.05）mRNA表达水平呈明显的正相关;与FLIP mRNA表达呈负相关（r=-0.582,P＜0.05）。3.Western-Blot检测PI3K、Akt、FoxO3a、FLIP、Bim、Caspase8、Caspase9各指标蛋白质表达水平与5mmol/L浓度组相比,15mmol/L,30mmol/L浓度组PI3K、Akt、FoxO3a、Bim、Caspase8、Caspase9蛋白表达水平明显升高（P＜0.05～0.01）;FLIP蛋白质表达水平降低（P＜0.05）。相关性分析显示（1）D-葡萄糖浓度与PI3K（r=0.395,P＜0.05）、Akt（r=0.436,P＜0.05）、FoxO3a（r=0.804,P＜0.01）、Bim（r=0.542,P＜0.05）、Caspase8（r=0.658,P＜0.01）、Caspase9（r=0.507,P＜0.05）蛋白质表达水平呈明显的正相关;与FLIP蛋白质表达水平呈负相关（r=-0.696,P＜0.01）。（2）心肌细胞凋亡率与PI3K（r=0.484,P＜0.05）、Akt（r=0.531,P＜0.05）、FoxO3a（r=0.846,P＜0.01）、Bim（r=0.570,P＜0.05）、Caspase8（r=0.705,P＜0.01）、Caspase9（r=0.543,P＜0.05）蛋白质表达水平呈明显的正相关;与FLIP蛋白质表达水平呈负相关（r=-0.709,P＜0.01）。结论1.不同浓度的高糖对Wistar大鼠离体培养的心肌细胞均具有致凋亡的作用,且符合浓度—效应的一般对应规律;2.FoxO3a通过PI3K/Akt信号转导通路参与了Wistar大鼠离体培养的心肌细胞的凋亡;3.FoxO3a通过其下游的凋亡基因FLIP、Bim、Caspase8、Caspase9参与了心肌细胞的凋亡。

论文目录

• 论文Ⅰ FoxO3a及其信号转导通路在糖尿病性心肌病心肌细胞凋亡中的作用及瑞舒伐他汀的干预研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图表
• 参考文献
• 论文Ⅱ FoxO3a在高糖对心肌细胞凋亡中的作用及其信号转导机制的研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图表
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士期间发表论文及科研情况
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 发表论文