环氧化物水解酶的生产及其在环氧氯丙烷手性拆分中的应用

论文摘要

手性环氧氯丙烷（ECH）是一种高价值的中间体,用以合成药制品和农用化学品,具有广阔的市场前景。手性环氧氯丙烷的合成方法有化学法和生物法,化学法主要使用Salen-Co催化剂,选择性差,成本高,对环境污染严重。生物法选择性较好,且对环境友好。目前全世界的环氧氯丙烷已经出现供大于求的局面,这必将使其价格降低,因此利用廉价的环氧氯丙烷来生产具有社会效益和经济效益的手性化合物将成为研究的热点和前沿。本论文通过生物细胞和固定化酶这两种典型的生物催化剂,来设计催化生产手性环氧氯丙烷的工艺路线,就生物催化剂的表征,制备和应用等方面展开研究。本文首先考察了实验室里筛选到的细菌A.mediolanus ZJB09106的产酶条件,通过单因素试验和正交法优化,获得了该菌株产环氧化物水解酶的较优培养基组分为:柠檬酸钠22.3 g/1,淀粉10.0 g/1,牛肉膏16.0g/l,酵母浸出汁10.0g/l,NaCl5.00g/l。同时也确定最适宜的培养条件为:初始pH 6.5,接种量3%（v/v）,装液量100 ml/500 ml。在上述条件下培养32小时后,生物量达到了 4.32 g/1,环氧化物水解酶的酶活力达到了 396.08 U/1。论文还对A.mediolanus ZJB09106的环氧化物水解酶进行了分离纯化和鉴定,通过超声波破碎,硫酸铵沉淀,离子交换层析等步骤,得到该酶的分子量为28 KD左右,纯化倍数为12.4倍,得率为15.2%。通过肽指纹谱图分析,确定该酶和Arthrobactersp.Strain AD2的Haloalcohol Dehalogenase HheA 和Corynebacteri m sp.StrainN-1074的Haloalcohol Dehalogenase HheA具有同源性。通过蛋白质N端的鉴定,确定其前7个氨基酸序列依次为MRIALVT.论文最后用基因工程菌破碎后的粗酶作固定化来手性拆分环氧氯丙烷,考察了固定化酶催化环境对其酶活与选择性的影响。选择了正己烷作为有机相,得到了最佳的固定化酶转化条件:pH7.5,温度30℃,含水量为1.0%。当加入底物浓度为20mM,16小时后,ee值达到100%,得率为10.7%,重复使用7次后,酶活保持在初始酶活的40%左右。经反应条件优化,通过双倒数作图法,求得该反应条件下的反应动力学参数:Vmax=2.331 mmolmin-1g-1,Km=76.28 mmol/l。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 手性化合物简介
• 1.2 手性环氧氯丙烷简介及生产方法
• 1.2.1 化学法生产手性环氧氯丙烷
• 1.2.2 生物法生产手性环氧氯丙烷
• 1.2.2.1 生物法拆分
• 1.2.2.2 生物法不对称合成
• 1.3 环氧化物水解酶
• 1.4 环氧化物水解酶的分离纯化简介[74-78]
• 1.4.1 细胞破碎
• 1.4.2 酶的抽提
• 1.4.3 酶的精制
• 1.5 环氧化物水解酶的固定化简介[82-84]
• 1.6 本论文的研究内容
• 参考文献
• 第二章 环氧化物水解酶的产酶条件研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料和方法
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 主要实验仪器
• 2.2.4 培养基
• 2.2.5 菌体培养
• 2.2.6 酶活定义
• 2.2.7 转化
• 2.2.8 生物量测定
• 2.2.9 环氧氯丙烷的分析检测
• 2.2.9.1 GC检测
• 2.2.9.2 手性GC检测
• 2.2.10 实验设计
• 2.2.11 正交试验的水平因子表
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 碳源的筛选
• 2.3.2 不同淀粉/柠檬酸钠比例对菌体生长和产酶的影响
• 2.3.3 氮源的筛选
• 2.3.4 不同酵母浸出汁/牛肉膏比例对菌体生长和产酶的影响
• 2.3.5 金属离子对菌体生长和产酶的影响
• 2.3.6 添加醇类、三元环类化合物对菌体生长和产酶的影响
• 2.3.7 诱导剂浓度对菌体生长及产酶的影响
• 2.3.8 正交试验优化培养基
• 2.3.9 接种量对菌体生长及其产酶的影响
• 2.3.10 起始pH对菌体生长及其产酶的影响
• 2.3.11 装液量对菌体生长及其产酶的影响
• 2.3.12 菌体生长曲线和产酶曲线的测定
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 环氧化物水解酶的分离纯化及鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料和方法
• 3.2.1 菌种与培养基
• 3.2.2 主要仪器和试剂
• 3.2.2.1 主要仪器
• 3.2.2.2 主要试剂
• 3.2.3 静息细胞的制备
• 3.2.4 Bradford法测定蛋白质浓度
• 3.2.4.1 考马斯亮蓝G-250溶液配制
• 3.2.4.2 标准蛋白溶液配制
• 3.2.4.3 蛋白质标准曲线绘制
• 3.2.5 菌体的破碎
• 3.2.6 硫酸铵沉淀
• 3.2.7 脱盐
• 3.2.8 离子交换层析柱纯化
• 3.2.9 SDS-PAGE进行目的蛋白分析
• 3.2.10 酶的鉴定
• 3.2.10.1 肽指纹谱图分析
• 3.2.10.2 酶的N端序列分析
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 超声波破碎
• 3.3.2 硫酸铵沉淀
• 3.3.3 脱盐
• 3.3.4 纯化结果
• 3.3.5 酶的鉴定
• 3.3.5.1 肽指纹谱图分析
• 3.3.5.2 蛋白质的N端序列测定
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 固定化环氧化物水解酶有机相中拆分环氧氯丙烷
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料和方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基及试剂
• 4.2.3 实验仪器
• 4.2.4 培养条件
• 4.2.5 菌体的破碎
• 4.2.6 粗酶粉的制备
• 4.2.7 酶的固定化
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 有机溶剂对催化反应的得率和对映选择性的影响
• 4.3.2 载体和酶比例对固定化效果的影响
• 4.3.3 固定化时间对酶活的影响
• 4.3.4 固定化酶量对比酶活的影响
• 4.3.5 温度对酶活性的影响
• 4.3.6 pH对酶活性的影响
• 4.3.7 体系初始水含量对酶活的影响
• 4.3.8 不同底物浓度对拆分ECH的影响
• 4.3.9 固定化酶手性拆分ECH
• 4.3.10 反应批次
• 4.3.11 反应动力学
• 4.3.11.1 底物浓度对初始反应速率的影响
• 4.3.11.2 产物浓度对初始反应速率的影响
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 附录1 本文所用到的缓冲液配方
• 附录2 蛋白质N端序列测定图谱
• 攻读学位期间发表的论文
• 致谢