论文摘要
背景急性心肌梗死已经成为威胁人类生命健康的最重要心血管疾病之一。除可能引起猝死外,严重而持续的缺血导致心肌细胞死亡、存活心肌减少,从而可引起心力衰竭的发生。再灌注治疗的应用极大的改变了心肌梗死的预后,然而人们并没有满足于此。研究表明,在急性心肌梗死的中心区域主要表现为坏死,而在梗死周边的轻中度缺血区则以凋亡为主,包括少量的自体吞噬。进行积极有效的再灌注治疗虽可减少心肌坏死,却不能抑制心肌细胞凋亡,相反再灌注损伤还有加重凋亡的可能。心肌细胞凋亡不仅能导致心肌梗死范围扩大,更重要的是在梗死后心功能的恶化过程中发挥着重要的作用,抑制凋亡可明显缩小心肌梗死面积和抑制心功能的恶化。因此有学者认为如果能有效地抑制缺血导致的心肌细胞凋亡,将可能具有与再灌注治疗同样重要的价值。近年发现的Apelin/APJ信号系具有调节心血管内环境稳定、拮抗肾素-血管紧张素系统-醛固酮（RAAS）激活等作用,同时有研究发现外源性Apelin通过激活磷脂酸肌醇三激酶（phosphatidylinositol3-OH kinaSe（PI3K）/Akt,PI3K/Akt）通路抑制成骨细胞的凋亡。然而,Apelin是否具有抑制心肌细胞凋亡的作用,Apelin能否通过抑制心肌细胞凋亡在急性心肌缺血损伤中发挥保护作用尚不清楚。Apelin是1998年日本学者Tatemoto等利用孤儿受体策略,以反向药理学方法从牛胃组织提取物中分离出的一个小分子多肽,为G蛋白偶联受体APJ（AngiotensinⅡProtein J,APJ）的内源性配体。现已纯化的有Apelin-10、11、12、13、15、17、19、28、36等多种肽,不同的肽片段具有不同的生物学效应,其中Apelin-13生物活性可能最强。Apelin/APJ信号在中枢神经系统及外周组织广泛表达,与血管紧张素Ⅱ/血管紧张素ⅡⅠ型受体（AngiotensinⅡType 1,AT1）信号系统分布相似,而病理生理作用与之相反。具有调节免疫、降低血压、增强心肌收缩力、保护心肌损伤、促进新生血管生成、抑制成骨细胞凋亡、调节水盐及脂肪代谢等作用。Apelin在早期及代偿性慢性心力衰竭中表达增高,而在严重心力衰竭时表达下降。然而,内源性Apelin/APJ信号系统在急性心肌损伤或心脏应激时的表达情况及其病理生理学意义尚不清楚。在慢性心衰动物模型中,外源性Apelin输入能够改善心脏功能、抑制心室重构,从而防止心衰的恶化。而许多动物模型发现,低水平持续增加的细胞凋亡是慢性心衰恶化的重要原因。同时在急性心肌梗死模型中,外源性Apelin输入能降低梗死面积。这两方面资料均提示Apelin的保护作用可能与防止心肌细胞发生不可逆死亡有关,然而目前尚未见相关的实验研究。本课题旨在通过观察Apelin/APJ系统在不同时间心肌缺血时的变化,探索内源性Apelin是否作为一种代偿或保护因素参与急性心肌缺血损伤;外源性给予Apelin能否减轻心肌缺血损伤而发挥心脏保护作用;Apelin的心脏保护作用是否与抑制心肌细胞凋亡有关;本文将进一步从信号转导水平探讨抑制细胞凋亡、提高细胞活力的信号通路PI3K╱Akt及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target ofrapamycin,mTOR）与Apelin在急性心肌缺血损伤中的保护作用机制的关系。目的1、探讨内源性Apelin/APJ系统在不同时间心肌缺血性损伤时的表达变化。2、外源性给予不同剂量Apelin-13对大鼠心肌缺血损伤的保护作用。3、Apelin-13与心肌细胞凋亡的关系,Apelin-13是否具有抑制缺血性心肌细胞凋亡的作用。4、探讨Apelin-13对心肌缺血损伤的保护作用与抑制细胞凋亡、提高细胞活力的信号通路PI3K/Akt及mTOR的关系。方法1、离体和在体水平检测Apelin/APJ信号在不同时间心肌缺血性损伤时的表达情况（1）心肌细胞培养,通过葡萄糖剥夺（glucose deprivation,GD）模拟心肌细胞缺血模型。RT-PCR法检测不同缺血时间Apelin及APJ mRNA表达情况,MTT法检测心肌细胞活力变化。（2）大鼠冠状动脉前降支结扎,建立在体不同时间的心肌缺血模型。酶联免疫法（ELISA）测定大鼠心肌缺血损伤时血浆及心肌组织Apelin含量。2、外源性Apelin-13对大鼠急性心肌缺血损伤的保护作用。大鼠冠状动脉前降支结扎120 min,观察不同剂量Apelin-13预处理对大鼠左室最大收缩压（LVESP）、左室舒张末期压（LVEDP）、左室内压最大升降速度(LV±dp/dtmax)的影响。同时TUNEL法检测心肌细胞的凋亡,Western bloting法检测凋亡相关蛋白表达。3、Apelin-13对缺血性心肌细胞凋亡的保护作用及信号转导机制。（1）通过GD模拟心肌细胞缺血,流式细胞术检测GD 12 h时乳鼠心肌细胞凋亡情况,Apelin-13对GD诱导的心肌细胞凋亡的影响。（2）流式细胞术检测PI3K阻断剂LY294002或mTOR阻断剂雷帕霉素对Apelin-13的抗心肌细胞凋亡作用的影响。Western bloting检测Bcl-2、Bax、Caspase-3和总的与磷酸化Akt及磷酸化mTOR在心肌细胞中表达。结果1、不同时间GD对培养的乳鼠心肌细胞Apelin及APJ mRNA表达影响:心肌细胞GD 6～24 h,Apelin及APJ mRNA表达高于基础水平,而在GD 36 h时Apelin及APJ mRNA表达则降至基础水平以下。2、大鼠急性心肌缺血时心肌组织及血浆Apelin含量变化:ELISA检测结果显示,大鼠心肌缺血30～60 min时,大鼠心肌组织Apelin含量逐渐增高,而缺血120 min时Apelin含量降至正常水平以下,血浆中Apelin含量在缺血120 min内呈逐渐增高趋势。3、外源性Apelin-13对大鼠心脏功能的影响:与假手术组比较,大鼠心肌缺血120 min时（模型组）LV±dp/dtmax、LVESP明显降低,LVEDP明显增高（均P＜0.01）;高剂量Apelin-13组（100μg/kg）能明显提高LV±dp/dtmax、LVESP,降低LVEDP（P＜0.01、0.05、0.01）。低剂量Apelin-13组（10μg/kg）LVEDP降低（P＜0.05）,而LV±dp/dtmax、LVESP无明显改善。4、Apelin-13对大鼠心肌细胞凋亡的影响:TUNEL检测显示模型组可见大量凋亡细胞,高剂量Apelin-13组心肌细胞凋亡指数明显下降（33.3±2.9%vs45.1±0.7%,P＜0.01）;Western bloting检测显示高剂量Apelin-13组明显抑制促凋亡基因Bax、Caspase-3的表达并提高抗凋亡基因Bcl-2的表达。5、Apelin-13对GD诱导的缺血性心肌细胞凋亡的影响:流式细胞术显示GD12 h后心肌细胞凋亡明显增加。Apelin-13（100 nM）预处理明显抑制心肌细胞凋亡,提高心肌细胞活力（39.16±0.75%vs 50.25±5.9%;P＜0.05）;同时Apelin-13（100 nM）明显抑制Bax、Caspase-3的表达并提高Bcl-2的表达。6、Apelin-13的抗心肌细胞凋亡作用与PI3K/Akt及mTOR信号通路的关系:Western bloting检测显示Apelin-13（100 nM）明显增加磷酸化Akt（p-Akt）及mTOR（p-mTOR）的表达,而p-Akt及p-mTOR的表达分别被LY294002及雷帕霉素所抑制;Apelin-13对心肌细胞凋亡的保护作用被LY294002而非雷帕霉素所抑制。提示Apelin-13通过激活PI3K/Akt信号通路抑制缺血性心肌细胞凋亡。结论1、心肌Apelin/APJ信号表达与心肌缺血的持续时间有关。短时间心肌缺血Apelin/APJ信号表达增加,长时间持续缺血则表达下降。2、Apelin-13对急性心肌缺血诱导的心肌细胞损伤具有保护作用,同时这种保护作用是呈剂量依赖的。3、在急性心肌缺血损伤时,Apelin-13可通过抑制心肌细胞凋亡发挥心脏保护作用。4、Apelin-13抑制缺血性心肌细胞凋亡的作用是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的。
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