抗PEA单抗和单链抗体制备及在绿脓感染中的应用

论文摘要

绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginodsa PA）是导致外科手术或烧伤细菌感染死亡的最主要的病原细菌之一。绿脓杆菌外毒素A（PEA）是该菌的主要致病因子之一。PEA分为三个（IIII）功能区,I区与易感细胞识别有关;II区与PEA的“跨膜移位”有关;III区具有细胞毒性作用。PEA的毒性是其I区与细胞表面受体结合后,由受体介导的一系列反应引发的。所以抑制I区与受体的结合就可以阻断毒素的全部毒性作用。为获得绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白,本研究将PEA受体结合区亚单位基因克隆到表达载体pET28（c）中,构建了原核表达质粒pET-28（c）+B10,表达了重组的绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白,进行了免疫学实验。进而利用该蛋白免疫Balb/c小鼠制备了抗PEA单克隆抗体,抗PEA（3C6）单克隆抗体经过正辛酸和硫酸铵纯化后,对严重绿脓杆菌感染小鼠进行了疗效实验,效果明显。在此基础上,采用RT-PCR重叠延伸剪接法方法构建了单链抗体基因,并将基因克隆入pET28a中,筛选得到重组表达质粒pET28a-（PEA-1）ScFv。通过表达、变性、复性、纯化之后,进行了PEA的细胞毒性抑制实验。单链抗体在高浓度下能够起到一定的抑制作用。本研究旨在寻求治疗烧伤后绿脓杆菌感染的新方法新途径。

论文目录

• 提要
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 烧伤感染及绿脓杆菌外毒素 A
• 第二章 单链抗体研究进展
• 第二篇 研究内容
• 第一章 重组 PEA 受体结合区基因在大肠杆菌中的表达及免疫实验
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二章 抗 PEA 受体结合区单克隆抗体的制备与鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 抗 PEA 受体结合区单克隆抗体在严重绿脓杆菌感染中的作用
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 抗 PEA 单链抗体基因的克隆及原核表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第五章 （PEA-1）ScFv 表达纯化复性与生物学特性的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的学术论文及其他成果
• 中文摘要
• 英文摘要
• 致谢
• 导师简介
• 作者简介
• CURRICULUM VITAE