始旋链霉菌普那霉素的固定化及原位分离发酵

论文摘要

普那霉素是一种由始旋链霉菌（Streptomyces pristinaespiralis）产生的链阳性菌素类抗生素,对大多数革兰氏阳性菌,包括万古霉素耐受的肠球菌等耐药菌均具有较理想的杀菌活性,因此被公认为对付顽固性革兰氏阳性菌感染的首选药物。本文以提高普那霉素的产量及生产效率为目标,引入始旋链霉菌的固定化发酵新工艺,对固定化发酵条件、固定化半连续发酵操作策略进行了较为系统的研究;同时,进一步深入探讨JD-1树脂吸附分离原位耦合发酵普那霉素的动力学过程,并建立有效数学模型。通过对照实验筛选得到了较优的用于始旋链霉菌普那霉素固定化发酵的固定化载体——聚氨酯海绵（33FR50）。载体添加量和添加时机的单因素实验表明,随着载体添加量的增加,发酵液粘稠度下降,但普那霉素产量稍有下降;载体添加时间越晚,对菌体的固定化能力越弱,但对产物普那霉素合成的不利干扰会越小。在此基础上确立了载体添加量为聚氨酯海绵8块（1 cm×1 cm×1 cm）,添加时机为发酵至24h时。以正交设计法设计变温发酵实验以考察发酵过程的理性变温可能给固定化发酵带来的有利效应。结果表明,较理想的温度控制方式是:0～36h为28℃,36～72h为23℃,72～84h为25℃。较优工艺下的固定化普那霉素发酵产量由155mg/L提高至212mg/L。采用以响应面为主的统计学方法对始旋链霉菌普那霉素固定化发酵条件进行了优化,优化后各主要因素的水平为:种子瓶装液量29.4mL,发酵瓶装液量28.8mL,种子培养摇床转速204rpm,条件优化后的实际普那霉素平均发酵产量为230.2 mg/L,与预测值接近。探索了始旋链霉菌固定化半连续发酵合成普那霉素的新工艺。分别采用三种营养成分含量显著不同的培养基作为半连续发酵过程中的生产培养基,并进行适当的换料及控温策略,实验结果初步肯定了固定化始旋链霉菌重复利用的优良特性。建立了针对产物合成期的扩展Michaelis-Menten型动力学方程和液膜-孔扩散双阻力模型,回归得到了产物生成速率常数、产物抑制常数及液膜传质和孔内扩散系数。单因素实验表明,普那霉素生成速率常数及产量随着树脂粒径的减卸龃?在一定范围内随着树脂添加量的增大而增大,但当添加量达到一定程度时,产量反而降低,这与剪切力增大有关。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 主要符号说明
• 1 前言
• 1.1 普那霉素的研究进展
• 1.1.1 普那霉素概述
• 1.1.2 普那霉素的应用
• 1.1.3 普那霉素生物合成的研究进展
• 1.2 细胞固定化技术
• 1.2.1 固定化方法的分类
• 1.2.2 固定化载体的分类与选择
• 1.2.3 固定化微生物生理学
• 1.3 连续发酵与半连续发酵
• 1.4 树脂吸附原位分离技术在生物合成中的应用
• 1.4.1 大孔吸附树脂概述
• 1.4.2 大孔吸附树脂在原位分离技术上的应用
• 1.4.3 大孔吸附树脂在普那霉素原位分离耦合发酵上的应用
• 1.5 论文的研究目标与思路
• 2 固定化介质的选择及影响固定化发酵的因素
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.3 分析方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 固定化载体的筛选
• 2.3.2 载体用量的影响
• 2.3.3 固定化载体的添加时间
• 2.3.4 固定化始旋链霉菌的变温发酵
• 2.4 本章小结
• 3 普那霉素固定化发酵工艺的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.3 分析方法
• 3.2.4 实验设计方法
• 3.2.5 数据处理
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 固定化方式的选择
• 3.3.2 影响固定化始旋链霉菌普那霉素发酵的重要因素
• 3.3.3 最陡爬坡实验得到CCD中心点
• 3.3.4 响应面的拟合及最佳条件的确定
• 3.4 本章小结
• 4 固定化半连续发酵
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.3 分析方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 载体与液相主体中的普那霉素分配
• 4.3.2 半连续发酵
• 4.4 讨论
• 5 普那霉素发酵与吸附分离耦合过程动力学研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.3 分析方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 JD-1树脂吸附动力学过程
• 5.3.2 吸附动力学模型
• 5.3.3 原位吸附分离耦合数学模型
• 5.4 本章小结
• 6 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 今后工作的建议
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文