尸食性蝇类的分子鉴别及其发育生物化学特征用于死后间隔时间推断的基础研究

论文摘要

本文针对当前法医昆虫学中尸食性蝇类的幼期不易鉴别,以及可用于死后间隔时间推断的日龄指标较为缺乏之现状,就尸食性蝇类幼期种类的分子鉴别与其生长发育过程中蛋白质、糖类和脂类以及贮藏蛋白等生化特征的变化进行了系统测定,进而分析这些变化规律用于蝇类日龄推断的可行性,获得下列结果: 1.杭州地区常见尸食性蝇类的序列分析 通过DNA的序列测定,对杭州地区常见的六种尸食性蝇类——巨尾阿丽蝇Aldrichina grahami（Aldrich）、大头金蝇Chrysomya megacephala（Fabricius）、丝光绿蝇Lucilia sericata（Meigen）、棕尾别麻蝇Boettchereisca peregrina（Robineau-Desvoidy）、肥须亚麻蝇Parasarcophaga crassipalpis（Macquart）、家蝇Musca domestica Linnaeus进行分子鉴定,在六个种类间成功的扩增到了mt DNA COⅡ基因的部分序列。DNA测序结果表明不同种类间的序列差异达到10%,而同一种类不同个体之间几乎没有差异,差异在1%以下。 2.双向凝胶电泳图谱用于常见尸食性蝇类初孵幼虫的鉴别 双向电泳分析技术已在生物科学各领域被广泛应用,蛋白质组作图的意义已经日益显现。通过对四种常见尸食性蝇类大头金蝇Chrysomya megacephala（Fabricius）、棕尾别麻蝇Boettcherisca peregrina（Robineau-Desvoidy）、肥须亚麻蝇Parasarcophaga crassipalpis（Macquart）和巨尾阿丽蝇Aldrichina grahami（Aldrich）初孵幼虫蛋白质组双向凝胶电泳和图象分析,发现各种类间双向电泳图谱差异显著,并对相应的等电点和相对分子量值进行聚类和判别分析,结果表明建立合适的尸食性蝇类初孵幼虫的双向电泳图谱有利于鉴别形态学极易混淆的昆虫种类。 3.巨尾阿丽蝇离食期幼虫肠道内容物的mt DNA检测 以猪的mt DNA作为靶标,在幼虫体内成功的扩增到了肠道内容物的DNA,经序列比较与食源完全一致。研究结果表明,Cyt b基因不仅能在嗉囊中检测到也能从整个虫体中检测到,且前者的PCR产物比后者的PCR产物更明显。随着巨尾阿丽蝇幼虫消化时间的延长猪cytb基因可检测到的概率随之下降。在这里可用改进的Logistic曲线方程表示巨尾阿丽蝇幼虫消化食物的时间与能检测到的概率关系模拟为:y=exp（a+b*x）/（1+exp（a+b*x））。（y表示可检测到的概率,x表示消化的时间,a、b两个常数）,并给出了不同温度下的模拟方程。 4.尸食性蝇类幼期蛋白质、脂类、糖含量和体重随发育变化的时间特征 24℃下四种不同蝇类幼虫体重随着发育都在3日龄达到最大体重,之后随着日龄增加而逐渐降低。蝇类幼虫的体重变化可以用改进的Logistic曲线拟合其和日龄的关系。不同种类蝇类体重在蛹期呈不明显的下降趋势,其与日龄的关系可以线性关系拟合。 24℃下四种不同蝇类幼虫蛋白质随着发育都在3日龄后变化不明显。蝇类幼虫的蛋白质含量变化可以用改进的Logistic曲线拟合其和日龄的关系。不同种类蝇类蛋白质含量在蛹期也呈逐渐下降趋势,其与日龄的关系可以线性关系拟合。 24℃下不同蝇类幼虫总糖随着发育在4日龄后变化不明显。蝇类幼虫的总糖含量变化可以用

论文目录

• 中文摘要
• 目录
• 前言
• 第一部分 文献综述
• 第一章 法医昆虫学研究进展
• 1 尸食性昆虫种类鉴定
• 1.1 电镜技术在法医昆虫学中的应用
• 1.2 DNA鉴定
• 1.3 昆虫表皮碳氢化合物
• 2 死亡时间推断
• 2.1 昆虫区系演替和死亡时间推断的关系
• 2.2 昆虫发育与死亡时间推断
• 2.3 新的用于死亡时间间隔的指示物种的寻找
• 3 法医昆虫毒理学
• 3.1 药物（毒物）检测
• 3.2 药物对双翅目昆虫生长发育的影响
• 4 计算机技术
• 5 昆虫体内食物来源的研究
• 6 展望
• 第二章 蛋白质组学在昆虫学中的应用
• 1 蛋白组学研究的关键技术平台
• 1.1 双向电泳
• 1.2 生物质谱分析
• 2 在昆虫学研究中的应用
• 2.1 果蝇蛋白质组研究
• 2.2 媒介昆虫与病原体蛋白质组研究
• 2.3 昆虫表皮蛋白
• 2.4 差异表达
• 3 前景和展望
• 第三章 昆虫贮藏蛋白
• 1 贮藏蛋白家族
• 1.1 概述
• 1.2 贮藏蛋白的分类
• 1.3 结论
• 2 蛋白的贮藏和利用
• 2.1 双翅目
• 2.2 鳞翅目
• 2.3 结论
• 3 作为时间特征性生化指标的可行性
• 第二部分 试验研究
• 第一章 杭州地区常见尸食性蝇类的分子鉴别
• 1 材料与方法
• 1.1 供试虫源
• 1.2 DNA抽提
• 1.3 扩增及测序
• 1.4 序列分析
• 2 结果
• 2.1 序列数据
• 2.2 系统发育
• 3 讨论
• 3.1 物种鉴定
• 3.2 地理种群间的差异探讨
• 第二章 双向凝胶电泳图谱用于常见尸食性蝇类初孵幼虫的鉴别
• 1 材料与方法
• 1.1 供试虫源和取样方法
• 1.2 试剂
• 1.3 蛋白质提取方法
• 1.4 双向凝胶电泳
• 1.5 蛋白质图谱扫描与分析
• 1.6 物种鉴别模型的建立方法
• 2 结果
• 2.1 双向凝胶电泳图谱
• 2.2 判别分析
• 3 讨论
• 第三章 巨尾阿丽蝇离食期幼虫肠道内容物的DNA检测
• 1 材料与方法
• 1.1 昆虫的饲养
• 1.2 取样和解剖
• 1.3 DNA提取
• 1.4 PCR扩增与测序
• 1.5 数据分析
• 2 结果
• 2.1 猪cyt b基因和组织确定
• 2.2 离食期后PCR检测概率随时间的变化
• 3 讨论
• 第四章 四种尸食性蝇类幼期蛋白质、脂类、糖含量和体重随发育变化的时间特征
• 1 材料与方法
• 1.1 供试虫源与取样方法
• 1.2 样品粗提液制备
• 1.3 蛋白质含量的测定
• 1.4 可溶性总糖的测定
• 1.5 海藻糖的测定
• 1.5 脂类含量的测定
• 1.6 数据分析
• 2 结果
• 2.1 体重与日龄的关系
• 2.2 蛋白质含量与日龄的关系
• 2.3 可溶性总糖含量与日龄的关系
• 2.4 海藻糖含量与日龄的关系
• 2.4 脂类含量与日龄的关系
• 3 讨论
• 第五章 温度对蝇类幼期蛋白质、脂类和总糖及体重变化的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 供试虫源
• 1.2 生化测定
• 1.3 数据分析
• 2 结果
• 2.1 体重
• 2.2 蛋白质含量
• 2.3 总糖含量
• 2.4 脂类含量
• 3 讨论
• 第六章 尸食性蝇类幼虫血淋巴可溶性蛋白组成的时间特征
• 1 材料与方法
• 1.1 供试虫源
• 1.2 血淋巴的收集
• 1.3 SDS-PAGE电泳
• 2 结果
• 2.1 肥须亚麻蝇
• 2.2 丝光绿蝇
• 3 讨论
• 第七章 肥须亚麻蝇幼虫血淋巴贮藏蛋白的纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 虫源
• 1.2 血淋巴取样
• 1.3 贮藏蛋白的分离纯化
• 1.4 SDS-PAGE电泳
• 2 结果
• 3 讨论
• 第八章 贮藏蛋白抗体制备与ELISA检测最佳反应条件建立
• 1 材料与方法
• 1.1 抗体制备
• 1.2 免疫印迹
• 1.3 抗体纯化与效价测定
• 1.4 抗原和包被抗体最佳稀释倍数确定
• 1.5 标准曲线
• 2 结果
• 3 讨论
• 第九章 两种麻蝇体内贮藏蛋白含量及温度对其的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 昆虫饲养与取样
• 1.2 间接ELISA法测定贮藏蛋白含量
• 1.3 数据分析
• 2 结果
• 2.1 不同温度下两种麻蝇幼虫期和蛹期贮藏蛋白和日龄的关系
• 2.2 自然温度下肥须亚麻蝇日龄的推断
• 3 讨论
• 第十章 总讨论
• 1 种类的鉴别
• 1.1 DNA分析技术
• 1.2 蛋白质组技术
• 2 蝇类幼期日龄推断
• 3 结语
• Abstract
• 参考文献
• 附录博士生期间发表和待发表文章
• 致谢