黄连素对成年鼠神经再生的影响及其对缺血性脑卒中神经保护的作用机制

论文摘要

黄连为我国特产药材之一,始载于东汉《神农本草经》,被列为上品。它的提取物和汤药在中医当中被运用了至少3000年之久。据不完全统计,13部宋代以前古代方书中有3.2万多方剂,含“黄连”的有1760个,即约5%左右的方剂中包含黄连。据《全国中成药品种目录》统计,以“黄连”作原料的中成药品种有黄连上清丸、复方黄连素片、加味香连丸等108种。黄连含有多种生物碱,以黄连素（俗称小蘖碱,berberine,BR）为主要有效成分。长期以来临床上将黄连素广泛应用于解热镇痛、抗肠道细菌感染,近二十年来,黄连素的许多药理作用机制（如抗菌、调节免疫、抗肿瘤、抗心律失常、抗动脉粥样硬化、降血压、调节糖脂代谢等）研究逐渐深入,尤其是调节糖脂代谢的临床疗效亦得到了验证和认可。然而黄连素作为一种可穿透血脑屏障、并可被神经元摄取的的天然药物,它在中枢神经系统的药理作用研究尚不充分和深入。它对脑缺血的神经保护作用、抗焦虑、抗成瘾的分子机制,以及对学习记忆、神经褪行性变及神经再生可能的影响;在脑内的药代动力学分布,作用的分子靶位,以及可能涉及的相关信号通路都有待进一步探索和研究。近年来有文献报道,给予大鼠静脉注射黄连素后发现药物在海马区浓集,而海马区是成年动物神经再生的两个主要脑区之一,那么基础状态下黄连素长期用药是否对中枢神经系统功能产生影响?黄连素是否能影响成年动物的神经再生,进而在脑卒中的治疗中发挥积极作用?这些方面的研究目前均尚未见报道。脑卒中（stroke）是危害人类健康的重大疾病,全世界每年有15000000人罹患该病,在全球已成为第一致残和第二致死的原因。其中缺血性脑卒中的发病率约占脑血管病的80%。引起急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke,AIS）最常见的原因是颈内或颅内血管的突然阻塞,导致脑组织急性缺糖缺氧。大脑局部缺血可引发缺血级联病理反应,最终造成缺血核心区内的神经细胞在卒中发作数分钟内死亡。基于脑缺血神经损伤机制与时程变化的研究,目前损伤早期抗兴奋性毒性、抗神经炎性和抗凋亡、损伤后期促组织修复、再生是脑卒中治疗的主要策略。但令人失望的是,迄今为止,许多在基础研究中效果显著的药物却未能在临床研究中获得满意的疗效甚至无效。而现有的研究显示黄连素可能对脑卒中具有预防及神经保护作用,那么其中确切的机制是什么?此外黄连素对脑缺血损伤后的组织修复和神经再生有无影响?目前均未见研究报道。因此本文工作首先研究黄连素对离体培养的神经干细胞及成年动物神经再生的影响,为发现黄连素的药理学新作用提供实验证据。然后分别制备缺血性损伤的整体和细胞模型研究黄连素在局部脑缺血再灌注模型中的保护作用及相关机制。第一部分黄连素对成年ICR小鼠神经再生的影响目的:研究长期服用黄连素对正常成年ICR小鼠神经再生和离体培养的神经干细胞增殖能力的影响。方法:80只ICR小鼠随机分为以下5组:对照组,20 mg·kg-1氟西汀组（阳性对照）,20、60和180 mg·kg-1黄连素组,灌胃给药,1次/天。第28天开始腹腔注射BrdU 100 mg·kg-1×3次（q 12 h）,最后一次BrdU注射12 h后每组取一半动物,应用Brdu免疫组织化学染色观察SGZ和SVZ脑区的神经再生;其余动物继续给药至56天,应用神经元特异性抗体NeuN、星形胶质细胞抗体GFAP与BrdU免疫荧光双染检测新生细胞的存活和分化。氚化胸腺嘧啶（tritiated thymidine,[3H]-TdR）摄取实验检测黄连素对原代培养的成年ICR小鼠神经干细胞增殖的影响。结果:1)黄连素长期给药降低小鼠的体重;2)黄连素长期给药不影响正常小鼠的血糖水平;3)免疫组化研究结果表明:黄连素长期灌胃给药不影响成年小鼠神经干细胞的增殖和分化,但能促进海马DG区新生细胞的存活;4)浓度低于10 nM时,黄连素不影响神经干细胞的增殖力;浓度大于100 nM时,黄连素呈浓度依赖性抑制神经干细胞的增殖。结论:长期给予黄连素使小鼠体重减轻,不影响海马DG区神经干细胞增殖,但能促进海马DG区新生细胞的存活;提示黄连素可能具有促神经组织修复的作用。第二部分黄连素对短暂性局部脑缺血再灌注模型小鼠的神经保护作用及其对模型小鼠神经再生的影响目的:研究黄连素急性给药对ICR小鼠局部缺血再灌注损伤的神经保护作用及中晚期给药对缺血后神经再生的影响。方法:采用线栓法制作小鼠tMCAO模型;于术前30 min及术后24 h分别给予部分小鼠黄连素20 mg·kg-1灌胃,MCAO 90 min再灌注48 h后应用2%红四氮唑（TTC）染色观察小鼠脑梗死体积的大小;尼氏染色观察海马区神经元死亡;另一部分动物术后3天随机分配至5组:对照组,McA0组,20、60和180 mg·kg-1黄连素组,灌胃给药,1次/天。第6天起给予BrdU(50 mg·kg-1,ip.q12h×5次)标记新生细胞,于术后第9天处死所有动物,灌注取脑行免疫组织化学染色观察缺血后SGZ和SVZ脑区的神经再生。结果:1)黄连素能够显著改善tMCAO小鼠神经行为学障碍;2)黄连素能显著减小tMCAO小鼠脑梗死体积;3)黄连素减轻海马CAl区神经元的死亡;4)黄连素对局部脑缺血诱发的神经再生无影响。结论:早期给予黄连素对小鼠脑缺血病理损伤具有显著的神经保护作用,但卒中发生后给药对脑卒中损伤急性后期的神经干细胞增殖无影响。第三部分黄连素在氧糖剥夺致PC12细胞损伤模型中的作用及其机制研究目的:研究黄连素在氧糖剥夺-再灌注（OGD-R）所致PC12细胞损伤中的作用及相关机制。方法:给与PC12细胞OGD-R造模,模拟缺血缺氧再灌注损伤,采用MTT法观察细胞活力,Hoechst33342染色法检测凋亡,应用荧光探针DCFH-DA检测PCI2细胞内ROS的含量;Western blotting检测PC12细胞线粒体内细胞色素C和AIF的水平。结果:1)黄连素呈浓度依赖性减轻OGD-R引起的PC12细胞活力减低,其中1μM作用最强;2)1μM黄连素可显著减轻OGD-R引起的PCI2细胞凋亡;3)1μM黄连素可显著减少OGD-R引起的PC12细胞内ROS生成;4)1μM黄连素可显著减少OGD-R引起的PC12细胞线粒体细胞色素C和AIF的释放;结论:黄连素可减轻氧糖剥夺所致PC12细胞损伤,其机制与其抑制ROS生成、减少促凋亡蛋白细胞色素C和AIF释放,进而抑制细胞凋亡相关。综上所述,本文工作的主要创新之处在于:1、发现黄连素长期服用可促进正常成年鼠脑内新生细胞的存活;提示黄连素可能具有促神经组织修复的作用。2、黄连素可抑制OGD损伤引起ROS升高,以及细胞色素C和AIF的释放,提示黄连素的脑缺血保护作用与其抗氧化损伤作用相关。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 一、黄连素的药理研究进展
• 二、缺血性脑卒中的基础与临床
• 三、促神经再生是AIS神经保护治疗的重要策略
• 五、本文研究工作的主要内容及意义
• 第一部分 黄连素对成年ICR小鼠神经再生的影响
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 黄连素对短暂性局部脑缺血再灌注模型小鼠的神经保护作用及其对模型小鼠神经再生的影响
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分 黄连素在氧糖剥夺致PC12细胞损伤模型中的作用及其机制研究
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 结语
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表的研究论文
• 综述
• 致谢