抑癌基因WWOX对人肝癌细胞SMMC-7721的作用及其机制的初步研究

论文摘要

第一部分WWOX基因在肝细胞癌中的表达及其意义目的：研究原发性肝细胞癌（HCC）中WWOX基因的表达及其与HCC临床病理特征之间的关系。方法：采用免疫组织化学SP法和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测50例肝癌及其癌旁组织、15例肝外伤后正常肝组织标本中WWOX蛋白及mRNA的表达情况，并分析其与肝细胞癌的临床病理因素之间的关系。结果：在50例HCC中WWOX蛋白阳性表达率为38．00％（19／50），癌旁组织中的蛋白阳性表达率为72．00％（36／50），正常肝组织中全部呈阳性表达，HCC组织中WWOX蛋白阳性表达率显著低于相应癌旁及正常肝组织（P＜0．05）；WWOXmRNA在HCC组织中阳性表达率为42．00％（19／50），明显低于相应癌旁中的阳性表达84．00％（39／50）及正常肝组织的阳性表达100％（15／15）（P＜0．05）；WWOX蛋白的表达缺失与肿瘤的病理学分级、HbsAg是否阳性及有无门静脉癌栓有关（P＜0．05）。结论：WWOX蛋白的缺失与肝细胞癌的发生、发展、侵袭、转移过程有关，WWOX功能失活是肝细胞癌发生、发展的机制之一，提示WWOX可能成为一种新的分子指标，可用于肝细胞癌的诊断、治疗和监测患者的预后。第二部分WWOX基因真核表达载体的构建目的：从正常人体肝组织提取总RNA，利用RT-PCR法反应获得目的基因WWOX的cDNA片段，构建具备可进行细胞转染和容易被识别筛选的pEGFP-N1-WWOX质粒载体。方法：应用Trizol法从人体正常肝组织中提取mRNA，按照GeneBank公布的WWOX基因序列设计引物：5’端引物：5’-GGGAAGCTTTTGGAGCGGGAGTGAG-3’；3’端引物：5’-ATGGGATCCCAGCAGTTGTTGAAGTACA-3’。RT-PCR反应获得1 234bp大小的WWOX cDNA片段。WWOX和载体pEGFP-N1用HindⅢ、BamHⅠ进行双酶切，二者进行连接，构建包含目的基因WWOX的重组质粒pEGFP-N1-WWOX。结果：使用Trizol法分离和提取得到正常人体的总RNA，通过RT-PCR法反应获得目的基因WWOX cDNA片段，构建完成了能够稳定表达和具有筛选特征的pEGFP-N1-WWOX质粒载体，供后续转染和表达实验使用。结论：Trizol法简便快速提取到正常人体总RNA，RT-PCR法准确地获得目的基因WWOX cDNA片段，正确构建完成了pEGFP-N1-WWOX质粒载体。第三部分重组表达载体的转染及对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响目的：对重组pEGFP-N1-WWOX质粒载体进行扩增、纯化，将重组载体转染入肝癌SMMC-7721细胞中，筛选出阳性细胞克隆；并研究转染WWOX对SMMC-7721细胞的生长和侵袭力是否会受到抑制，是否会有显著的细胞凋亡出现，探讨WWOX是否会影响SMMC-7721的细胞周期进展和分布比例，以判断WWOX在肝细胞癌的发生和进展方面是否扮演着关键性的作用，进而说明WWOX是否是肝细胞癌病因学中的抑癌基因。方法：采用脂质体Li pofectami ne2000介导pEGFP-N1-WWOX在肝癌SMMC-7721细胞处于对数生长期进行转染，并采用含G418的培养基筛选一获得阳性克隆的整合了WWOX基因的SMMC-7721细胞，继续传代培养。检测转染前后WWOX mRNA和蛋白量，MTT法检测细胞增殖变化，Transwell小室测定细胞的体外侵袭能力。流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期变化情况。结果：MTT法观察显示，转染WWOX基因后的SMMC-7721细胞生长抑制率为（32．1±4．2）％，对照组为（10．4±2．3）％，两组比较p＜0．01，转染后细胞生长增殖受到明显的抑制。Transwell小室测定转染WWOX基因后的SMMC-7721细胞侵袭能力受到抑制。流式细胞仪检测转染WWOX基因后SMMC-7721细胞的细胞周期中G0／G1期占（64．90±1．03）％，对照组（44．24±2．35）％，两组比较p＜0．01，细胞凋亡率（17．96±1．2）％明显高于对照组（2．84±0．64）％，两组比较p＜0．01，显示WWOX基因诱导肝癌细胞的凋亡和细胞周期阻滞。结论：重组质粒pEGFP-N1-WWOX成功转染肝癌SMMC-7721细胞，筛选获得包含WWOX的阳性克隆SMMC-7721细胞。转染WWOX基因后SMMC-7721细胞生长增殖受到显著的抑制，WWOX通过阻滞肝癌SMMC-7721的细胞细胞周期进展诱导细胞的凋亡。第四部分抑癌基因WWOX转染对人肝癌裸鼠移植瘤的作用目的：构建裸鼠人肝癌动物模型，观察WWOX基因在体内对肿瘤的作用。方法：将转染pEGFP-N1-WWOX和转染空载体pEGFP-N1的SMMC-7721细胞分别接种裸鼠皮下，建立裸鼠人肝癌荷瘤模型，测量肿瘤的体积，质量，计算肿瘤抑制瘤。免疫组织化学法测定Bcl-2、CyclinD1蛋白的表达情况，TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡情况。结果：接种转染pEGFP-N1-WWOX细胞的裸鼠成瘤能力明显降低，瘤结节的体积小，抑制率为59．42％，免疫组化测定转染pEGFP-N1-WWOX的裸鼠移植瘤Bcl-2、CyclinD1的表达均降低，TUNEL法显示凋亡增加，凋亡指数（15．24±2．57）％。结论：转染pEGFP-N1-WWOX的肝癌SMMC-7721细胞成瘤性差，WWOX基因能抑制肝癌裸鼠移植瘤的发生和生长，并诱导其凋亡。

论文目录

• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、前言
• 四、正文:抑癌基因WWOX对人肝癌细胞SMMC-7721的作用及其机制的初步研究
• 第一部分:WWOX基因在肝细胞癌中的表达及其意义
• 一 材料与方法
• 二 结果
• 三 讨论
• 四 结论
• 五 参考文献
• 第二部分:WWOX基因真核表达载体的构建
• 一 材料与方法
• 二 结果
• 三 讨论
• 四 结论
• 五 参考文献
• 第三部分:重组表达载体的转染及对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响
• 一 材料与方法
• 二 结果
• 三 讨论
• 四 结论
• 五 参考文献
• 第四部分:抑癌基因WWOX转染对人肝癌裸鼠移植瘤的作用
• 一 材料与方法
• 二 结果
• 三 讨论
• 四 结论
• 五 参考文献
• 全文小结
• 五、综述
• 六、附录
• 七、致谢