单叶新月蕨和三叶新月蕨富集稀土元素的能力及稀土结合多肽结构的探讨

论文摘要

稀土元素（rare earth element,REE）的广泛应用使得其在土壤、环境乃至食物链中不断传递,所造成的潜在的环境和健康风险已经日益引起人们的关注,尤其是稀土元素日允许摄入量与农用安全性探讨已成为最新的研究热点。稀土含量过高时,不论是对植物的生长还是对动物的骨骼、脑部、脏器和内分泌系统等均具有潜在毒性。与传统污染土壤的化学和物理修复技术相比,近年来出现的植物修复技术提供了一种经济且有效的土壤污染治理途径,而且不会对环境造成二次污染或破坏。利用该技术进行土壤稀土污染治理的前提是找到对稀土元素具有特殊富集能力的植物种或基因型,即稀土元素的“超富集体”（hyperaccumulator）。但是与植物超富集重金属元素的机理研究相比,稀土元素超富集植物的研究相对较少,大多数研究集中于稀土元素在植物体内分异规律方面,对于稀土在植物体内富集的分子机理的研究有待深入。本文以稀土元素超富集植物单叶新月蕨（Pronephrium simplex）为对象,研究其在自然条件下对稀土元素的超富集能力,利用胁迫培养实验验证其耐受和富集能力,考察稀土元素在超富集植物体内的分布及赋存状态,分离表征在超富集过程中起重要作用的稀土结合多肽,探讨可能的超富集机理,为稀土污染的植物修复技术提供理论和实践依据。同时,介绍一种新发现的稀土元素超富集植物——三叶新月蕨（Pronephriumtriphyllum）。研究自然保护区内单叶新月蕨体内的稀土含量分布,结果显示,该植物叶片内的稀土含量高达1249.37μg g-1,是其生长地母土中稀土含量的51.8倍,是母土中生物可利用态稀土含量的650.7倍,表明单叶新月蕨对稀土元素具有很强的富集能力,是稀土元素超富集植物;且叶片中的稀土含量分异现象与其生长地母土中的一致。采用凝胶色谱和反相色谱纯化单叶新月蕨稀土结合多肽,通过MALDI-TOF-MS及ESI-IT-MS测得其分子量为5072 Da。研究不同浓度的Nd胁迫培养下,单叶新月蕨富集Nd的能力。结果发现,单叶新月蕨在500μg mL-1Nd3+胁迫下仍能生存,具有很强的耐受性;伴随Nd含量的增加,Ce含量降低而叶片中的结合多肽的表达增加,表明Nd可以被吸收进入叶片细胞内部诱导多肽的表达并与之结合。提取纯化得到的稀土结合多肽经ICPMS鉴定其Nd含量最高,分别是La和Ce的94.1和57.9倍,其分子量为5076Da。Nd取代了多肽中原来结合的Ce,导致胁迫前后的稀土结合多肽分子量相差4Da,表明单叶新月蕨对稀土元素具有特异性富集。经酸处理脱掉Nd后,该多肽稀土含量仅为原多肽的4.2%,脱去部分的HPLC/ESI-IT-MS的谱图,可以看出632Da的肽片段（5076-4444=632Da）可能是Nd在结合多肽中所处的区域。V8蛋白酶（Endoproteinase Glu-C）酶解得到的肽片段,在Mascot数据库中进行比对,解析得出片段含有-E-T-M-E-,-P-N-L-L-G-E-,-F-V-I-Y-E-和-F-V-I-A-的肽段。另外,本文对在福建南靖乐土亚热带雨林自然保护区发现的另一种蕨类植物三叶新月蕨也进行了稀土分布及赋存状态的研究。结果发现,该植物叶片内稀土含量高达1026.53μg g-1,是其生长地母土稀土含量的42.6倍,是生物可利用态稀土含量的557.9倍,其富集系数为K2（从生物可利用态到根）>K5（从叶柄到叶）>K3（从根到茎）>1>K4（从茎到叶柄）>K1（从土壤到生物可利用态）。稀土元素主要通过土壤到根、根到茎、叶柄到叶片这三个过程,不断地在植物体内得到富集,根据稀土元素超富集植物的定义,三叶新月蕨是一种尚未报道的全新的稀土元素超富集植物。进一步对三叶新月蕨的稀土结合多肽进行SEC-UV/ICPMS及反相纯化鉴定,其稀土结合多肽的分子量为5070.97Da。两者均为金星蕨科新月属,它们的叶片中存在一个分子量接近的稀土结合多肽,是否具有相关性,还有待深入研究。

论文目录

• 摘要（中文）
• 摘要（英文）
• 第一章 前言
• 1.1 稀土元素的性质、来源与应用
• 1.2 稀土元素的生物效应
• 1.2.1 稀土元素的生物有效性
• 1.2.2 稀土元素的毒性
• 1.3 植物修复技术的研究进展
• 1.3.1 植物修复技术的基本原理
• 1.3.2 超富集植物
• 1.3.3 植物超富集重金属的生理机制
• 1.3.4 生物体中的元素形态分析技术
• 1.3.5 重金属植物修复的尝试
• 1.4 稀土元素植物修复的研究进展
• 1.5 本研究的意义和主要内容
• 参考文献
• 第二章 自然条件下单叶新月蕨的稀土元素超富集特性
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.1.1 高效液相色谱工作条件
• 2.2.1.1.1 凝胶色谱工作条件
• 2.2.1.1.2 稀土结合肽的反相色谱分析工作条件
• 2.2.1.2 其它仪器及工作条件
• 2.2.2 药品与试剂
• 2.2.3 实验方法
• 2.2.3.1 植物壤样品的采集
• 2.2.3.2 单叶新月蕨中稀土元素含量的测定
• 2.2.3.3 细胞分级法分析稀土元素在体内的赋存状态
• 2.2.3.4 单叶新月蕨叶片中多肽的提取及条件优化
• 2.2.3.5 SEC-UV/ICPMS联用分析稀土结合多肽
• 2.2.3.6 RPLC-UV/ICPMS联用分析稀土结合多肽
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 稀土元素在单叶新月蕨体内的含量分布
• 2.3.2 稀土元素在叶片细胞内的富集规律
• 2.3.3 单叶新月蕨叶片粗蛋白提取pH条件的优化结果
• 2.3.4 稀土结合多肽的分离纯化
• 2.3.5 单叶新月蕨稀土结合多肽的MALDI-TOF-MS鉴定结果
• 2.3.6 单叶新月蕨稀土结合多肽的ESI-IT-MS分析结果
• 2.4 结论
• 参考文献
• 第三章 单叶新月蕨在轻稀土元素Nd胁迫培养下的耐受和富集特性
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂
• 3.2.1.1 植物培养液
• 3.2.1.2 蛋白提取试剂
• 3.2.1.3 氨基酸分析试剂
• 3.2.1.4 蛋白酶解试剂
• 3.2.1.5 其它试剂
• 3.2.2 色谱工作条件
• 3.2.2.1 凝胶色谱工作条件
• 3.2.2.2 稀土结合肽的反相色谱分析工作条件
• 3.2.2.3 氨基酸的反相色谱分析工作条件
• 3.2.2.4 酶解肽片段的反相色谱分析工作条件
• 3.2.3 其他仪器及工作条件
• 3.2.4 实验方法
• 3.2.4.1 植物的稀土元素胁迫培养
• 3.2.4.2 多肽的提取分离及纯化鉴定
• 3.2.4.3 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白定量
• 3.2.4.4 稀土结合多肽脱稀土元素的方法验证
• 3.2.4.5 稀土结合多肽的氨基酸分析
• 3.2.4.6 稀土结合多肽的酶解及肽片段的分析测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 单叶新月蕨在轻稀土Nd胁迫培养下的富集行为
• 3.3.2 单叶新月蕨稀土结合多肽的SEC-UV/ICPMS谱图
• 3.3.3 胁迫培养前后稀土结合多肽中稀土含量的变化
• 3.3.4 培养前后稀土结合多肽的MALDI-TOF-MS对比
• 3.3.5 单叶新月蕨稀土结合多肽的脱稀土方法验证结果及结构预测
• 3.3.6 单叶新月蕨稀土结合多肽的氨基酸分析结果
• 3.3.7 单叶新月蕨稀土结合多肽的酶解序列分析结果
• 3.4 结论
• 参考文献
• 第四章 三叶新月蕨富集稀土元素的机理探讨
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 实验仪器
• 4.2.2 药品与试剂
• 4.2.3 实验方法
• 4.2.3.1 植物及土壤样品的采集
• 4.2.3.2 样品中稀土元素含量的测定
• 4.2.3.3 细胞分级法分析稀土元素在体内的赋存状态
• 4.2.3.4 三叶新月蕨叶片中水溶性蛋白的纯化及鉴定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 植物及土壤中稀土元素的分布模式
• 4.3.2 稀土元素在三叶新月蕨叶片细胞内的分异富集规律
• 4.3.3 三叶新月蕨稀土结合多肽的分离纯化
• 4.3.4 三叶新月蕨稀土结合多肽的MALDI-TOF-MS鉴定
• 4.4 结论
• 参考文献
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 攻读硕士学位期间发表和待发表的论文
• 致谢