菊芋发酵生产L-乳酸的研究

论文摘要

近年来,国内外对L-乳酸的需求日趋增加,而我国L-乳酸的生产技术比较落后。菊芋作为一种生长能力强、抗盐碱、耐沙漠的作物,其在我国中西部地区的种植面积正以基地的形式逐年加大。菊芋深加工的研究引起了国内外学者的广泛关注,然而开展菊芋发酵生产L-乳酸的研究尚未见报道。由于乳酸菌自身不能利用菊粉,本研究采用一株菊粉酶活力较强的黑曲霉为产酶菌株,以乳酸杆菌G-01为L-乳酸生产出发菌株,对以菊芋为原料的L-乳酸的发酵法生产进行了研究。主要内容及结果如下:⑴通过对黑曲霉产菊粉酶培养基组成的优化,得到最佳培养基组成:葡萄糖40 g/L,蛋白胨30 g/L和蔗糖脂4 g/L。并在该优化条件下于30℃,140 r/min下进行摇瓶发酵,96 h后菊粉酶酶活力达到230 U/mL。进一步研究表明菊粉酶是一种诱导酶,从诱导效果上看,蔗糖酯相对于菊粉是一种更有效的合成诱导剂,该物质可以激活用于生产菊粉酶的mRNA的合成。同时由于蔗糖酯在溶液中相对于菊粉,更难水解,所以有着更强的和持续的诱导作用。研究还发现在使用葡萄糖作为碳源,蔗糖酯作为合成促进剂时,更有利于菌丝体的生长和酶的合成。通过对该株菌的基因和形态学分析,确定其为黑曲霉。⑵菊粉酶的提取,先采用30%饱和度的硫酸铵盐析,沉淀除杂,然后采用70%饱和度盐析,经透析除盐,聚乙二醇20000浓缩,得到总酶活25253U,单位酶活1262 U/mL,比酶活64.37 U/mg,回收率83%,纯化倍数2.36。进一步纯化表明黑曲霉产菊粉酶是由两种分子量相差较小的内切酶和外切酶组成,前者分子量在165～210 kDa,而后者的分子量在160～170 kDa。比较转化酶和菊粉酶在30℃的催化动力学发现:转化酶的Km=34.9 mmol/L,Vm=909μmol/min,菊粉酶的Km=68.3 mmol/L,Vm=476.2μmol/min,这表明转化酶的最大反应速率接近菊粉酶的2倍,然而达到最大反应速率所需底物的浓度却接近菊粉酶的一半。⑶通过DES和NTG对乳酸杆菌G-01进行诱变,并进行耐渗透驯化,使菌株以葡萄糖为底物产酸达到92.8 g/L,提高了近1倍。乳酸菌G-02菌株经过多次传代接种,表现出较好的传代稳定性。通过对该菌株的基因、形态学及代谢产物分析,确定其为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）,乳酸同型发酵,而且产物中L-乳酸的光学纯度达到95%以上,为一株较为理想的L-乳酸生产菌株。⑷为了消除菊粉酶合成体系中的产物抑制现象,降低发酵液中黑曲霉菌丝体密度,同时避免在同步糖化与发酵菊芋产乳酸工艺中的染菌问题,使乳酸杆菌在菊芋糖化酶液中提前形成优势菌群,本研究采用在黑曲霉产酶培养基中适时接入乳酸菌的混合培养工艺,并对混合培养工艺条件进行了优化。结果表明,在产酶培养开始12 h接入乳酸杆菌,可以显著提高黑曲霉后期产菊粉酶的活性,在优化的培养基中,经过60 h的培养,菊粉酶活力将达到250 U/mL,较参照水平（50 U/mL）提高了近4倍。进一步研究发现,乳酸菌的接入显著地降低了发酵液中可发酵性糖的浓度,发酵液中黑曲霉菌丝体浓度降低到参照的一半,而且黑曲霉的菌丝体形态发生了明显的改变,从而更有利于生存在竞争的环境中。⑸对采用同步糖化与发酵工艺利用菊芋生产L-乳酸的工艺进行了探索,研究发现最适发酵工艺为菊粉酶活量50 U/mL,接种量为35%,菊芋粉抑制浓度为230 g/L,碳酸钙浓度50 g/L。为了进一步提高乳酸发酵活力,将柠檬酸代谢引入乳酸发酵工艺,结果表明:柠檬酸代谢可以显著提高乳酸杆菌的抗酸胁迫能力和乳酸发酵活性,最适柠檬酸添加浓度为10 g/L。在最佳工艺条件下,通过采用50℃初始水解1h的补料发酵工艺,经40℃,30 h发酵,L-乳酸浓度达到141.5 g/L,得率为52.4g乳酸/100g菊芋粉。

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ABSTRACT

第一章绪论

1.1 菊芋概述

1.2 菊粉的特性

1.3 微生物菊粉酶的研究现状

1.4 菊粉酶的应用

1.5 同步糖化与发酵菊芋生产酒精的研究

1.6 乳酸的生产方法

1.6.1 发酵法

1.6.2 其它合成法及比较

1.7 国内外发酵生产L-乳酸的研究现状

1.8 我国乳酸工业特点和发展条件

1.9 近年来乳酸发酵原料的研究

1.10 选题的目的与意义

1.11 研究内容

第二章菊粉酶诱导合成工艺的优化

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 主要仪器

2.2.2 主要试剂

2.2.3 培养基及试剂

2.2.4 培养方法

2.2.5 黑曲霉的鉴定

2.3 结果与讨论

2.3.1 菊粉和蔗糖酯对黑曲霉产酶的影响

2.3.2 蔗糖酯对黑曲霉生长的影响

2.3.3 黑曲霉产菊粉酶的发酵条件的优化

2.3.4 黑曲霉菌株的形态学和基因鉴定

2.4 本章小结

第三章黑曲霉菊粉酶系的研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 主要仪器设备

3.2.2 主要试剂

3.2.3 实验方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 粗酶液的制备

3.3.2 盐析

3.3.3 色谱柱分离菊粉酶

3.3.4 菊粉酶催化动力学研究

3.4 本章小结

第四章高产 L-乳酸菌种的选育

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 出发菌株

4.2.2 实验仪器

4.2.3 实验试剂

4.2.4 培养基及培养方法

4.2.5 诱变方法

4.2.6 乳酸菌的鉴定

4.2.7 分析方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 活菌数量与OD 值及其菌体干重之间的关系

4.3.2 生长曲线的测定及诱变用细胞培养时间的确定

4.3.3 诱变剂量和时间的确定

4.3.4 L-乳酸菌种选育结果

4.3.5 乳酸菌G-02 传代稳定性研究

4.3.6 乳酸菌G-02 发酵产物分析

4.3.7 BLAST 比对

4.3.8 乳酸菌G-02 的细胞形态与种系谱系

4.4 本章小结

第五章多菌株混合发酵产菊粉酶工艺的研究

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 实验菌株

5.2.2 实验仪器与试剂

5.2.3 培养方法

5.2.4 分析方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 黑曲霉在单菌株培养与混合培养体系中菌体生长和产酶比较

5.3.2 乳酸菌接入时间对黑曲霉产菊粉酶的影响

5.3.3 混合培养体系对各菌株生长的影响

5.3.4 不同碳氮源对混合培养体系产酶的影响

5.3.5 混合培养体系产酶培养基组成的优化

5.4 本章小结

第六章同步糖化与发酵菊芋产L-乳酸的研究

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 主要试剂

6.2.2 主要仪器设备

6.2.3 菌种

6.2.4 原料

6.2.5 实验方法

6.2.6 检测方法

6.3 结果与讨论

6.3.1 酶活量与接种量对发酵的影响

6.3.2 菊芋粉和碳酸钙浓度对乳酸发酵的影响

6.3.3 SSF 工艺糖化动力学研究

6.3.4 菊芋粉初始水解时间对乳酸发酵的影响

6.3.5 补料发酵工艺对乳酸发酵的影响

6.3.6 柠檬酸代谢对乳酸发酵的影响

6.3.7 柠檬酸代谢对乳酸杆菌代谢流的影响

6.3.8 柠檬酸代谢对乳酸杆菌胞内代谢的影响

6.4 本章小结

第七章结论与展望

7.1 研究结论

7.2 课题展望

论文创新点

致谢

参考文献

附录一作者在攻读博士学位期间发表的论文

附录二分析图谱

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