单核细胞趋化蛋白-1对前列腺癌PC-3M细胞系转移作用的体外实验研究

论文摘要

作用的体外实验研究前列腺癌的发病率一直在欧美国家居高不下,目前仍高居男性恶性肿瘤发病率第二位。前列腺癌的发病原因复杂,且潜伏时间较长,患者往往无明显临床症状。近些年我国前列腺癌的发病率也呈逐年上升趋势,且多以中晚期患者居多,约有三分之一的患者出现骨转移症状。在过去的10年间,前列腺癌的治疗出现了新的思路,由以往只注重肿瘤治疗本身而改变为既治疗肿瘤同时又注重调节患者体内微环境。基于对肿瘤细胞与体内微环境间相互作用的新认识,进展性前列腺癌的治疗方法发生了改变。前列腺癌细胞和患者机体微环境内不同的细胞相互作用后,肿瘤细胞的生长得以增强,这一过程以破骨细胞的加入更为显著。这种肿瘤生长的过程是与患者自身产生的细胞因子类和炎症趋化因子类物质有关系的。越来越多的研究表明单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）在前列腺癌发展和转移过程中发挥重要作用。日前有国外学者指出MCP-1不但具有募集单核细胞的能力,还可以促进前列腺癌细胞增殖和转移。有学者指出MCP-1在前列腺癌转移中起到正性调节作用。单核细胞趋化蛋白-1也称趋化因子配体2（Chemokine ligand 2, CCL2）被认为是和骨转移发生有着最密切的关系。骨髓成骨细胞、内皮细胞、间质细胞以及前列腺癌细胞均可产生MCP-1,同时MCP-1与调控肿瘤相关性巨噬细胞和促进破骨细胞成熟也有密切关联。另外,MCP-1与其受体（CCR2）结合后可通过细胞的自分泌和旁分泌行为诱导前列腺癌细胞发生增殖、迁移和侵袭。MCP-1通过PI3K/AKT相关机制激活survivin基因,从而降低前列腺癌细胞的凋亡率。双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰,也被称为RNAi。双链RNA经酶切后会形成很多siRNA;信使RNA,即nRNA中的同源序列可以同这些siRNA的序列发生互补结合,从而致使mRNA失去应有的功能,使nRNA不能翻译产生蛋白质,达到基因沉默的效果。RNAi的治疗前景潜力巨大。许多疾病在基因病因学已经具有理论依据,并且有些疾病已经在体外试验和体内试验的模型中通过RNAi技术行靶向治疗。RNAi作为阻断肿瘤发生有关基因的有力手段已经越来越被重视。本研究是基于以上理论依据应用RNAi技术将MCP-1基因阻断,探索MCP-1在前列腺癌细胞生长、增殖、转移等方面的作用,并试图阐述以上机制。目的：本实验选用具有高度转移特性的人前列腺癌PC-3M细胞,并依托RNAi技术构建了pFIV-H1/U6-MCP-1 siRNA质粒（pFIV-si-MCP-1质粒）。探讨MCP-1在前列腺癌进展和转移过程中作用,同时应用pFIV-si-MCP-1质粒行RNAi抑制PC-3M细胞中MCP-1基因的实验,观察前列腺癌细胞的形态学变化及相关基因表达变化,以及前列腺癌细胞凋亡率变化,尝试为前列腺癌的治疗提供新线索。方法：设立control组,si-scramble组,MCP-1组和si-MCP-1组,si-scramble组和si-MCP-1组分别予以细胞转染pFIV-si-scramble质粒和pFIV-si-MCP-1质粒,MCP-1组给予50ng/ml的MCP-1细胞培养液。采用MTT细胞比色法观察各组肿瘤细胞的抑制率变化；应用细胞划痕实验观察肿瘤细胞迁移能力变化；应用Transwell细胞侵袭实验观察肿瘤细胞侵袭能力变化；ELISA检测肿瘤细胞内MCP-1蛋白含量变化；应用TUNEL和Annexin V-FITC流式细胞术检测细胞凋亡率变化；RT-PCR和Western blot检测VEGF.Caspase-3、MMP-9及MCP-1基因的转录与表达。结果：本研究结果表明,与control组和si-scramble组比较,MTT细胞比色法试验中观察到MCP-1具有肿瘤细胞增殖的作用,MCP-1组细胞增殖率可达30.44±0.12%,而pFIV-si-MCP-1质粒可明显抑制肿瘤细胞增殖,si-MCP-1组细胞抑制率为56.9±0.10%；细胞划痕实验观察到MCP-1可促进肿瘤细胞迁移,而pFIV-si-MCP-1质粒可明显抑制肿瘤细胞迁移；Transwell细胞侵袭实验观察到MCP-1可增强肿瘤细胞侵袭能力,MCP-1组穿过Matrigel胶的肿瘤细胞数量明显增多（P<0.01）,而pFIV-si-MCP-1质粒可明显抑制肿瘤细胞侵袭能力,肿瘤细胞转染pFIV-si-MCP-1质粒后侵袭细胞数量显著减少（P<0.01）；应用TUNEL及Annexin V-FITC处理各组细胞后激光共聚焦显微镜下观察和流式细胞仪检测均显示MCP-1可减少肿瘤细胞凋亡,而pFIV-si-MCP-1质粒可促进肿瘤细胞凋亡,各组细胞凋亡率分别为5.4±1.12％（control组）,7.0±3.24％（si-scramble组）,1.0±0.59%（MCP-1组）和40.8±3.02％（si-MCP-1组）；ELISA测定各组细胞蛋白中MCP-1含量分别为,63.5±11.60 pg/μg（control组）,64.9±11.07 pg/μg（si-scramble组）,88.1±8.45pg/μg（MCP-1组）和44.5±11.29 pg/μg（si-MCP-1组）,结果显示MCP-1具有自身促进产生作用,pFIV-si-MCP-1质粒可减少MCP-1产生；RT-PCR与Western blot结果提示MCP-1可使Caspase-3基因转录与翻译下调,同时促进MMP-9、VEGF及MCP-1本身基因转录与翻译上调,pFIV-si-MCP-1质粒则可使Caspase-3基因转录与翻译上调,同时MMP-9、VEGF及MCP-1本身基因转录与翻译下调。结论：1.实验证明MCP-1具有促进PC-3M细胞增殖作用和减少凋亡,并且增加PC-3M细胞侵袭能力的作用。2.上述作用与MCP-1上调VEGF、MMP-9表达和下调Caspase-3表达有关。3.实验证明pFIV-si-MCP-1质粒对PC-3M细胞具有降低肿瘤细胞侵袭能力和促进凋亡作用。4.上述作用与MCP-1表达受抑制后VEGF、MMP-9表达下调和Caspase-3表达上调有关。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 综述
• 1.1 前言
• 1.2 RNA干扰
• 1.2.1 siRNA的发现及作用
• 1.2.2 RNAi的机制及其生物学的重要性
• 1.2.3 RNAi在体内和体外的应用
• 1.2.4 siRNA的转运
• 1.2.5 RNAi的治疗前景
• 1.3 MCP-1在前列腺癌生长中发挥多重作用
• 1.3.1 MCP-1在前列腺癌各细胞系中特点
• 1.3.2 肿瘤病理分期及等级与CCR2表达的相关性
• 1.3.3 MCP-1通过自分泌和旁分泌作用刺激前列腺癌细胞增殖和迁移
• 1.3.4 MCP-1诱导Survivin并避免前列腺癌细胞自噬性死亡
• 1.3.5 由MCP-1介导的前列腺癌细胞对骨组织的破坏
• 1.3.6 MCP-1作为前列腺癌的治疗因素的意义
• 1.3.7 MCP-1与其他肿瘤的关系
• 1.3.8 血清MCP-1可以作为肿瘤生物标记物
• 1.4 结论
• 第2章 MCP-1对PC-3M影响的实验研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 质粒和菌株
• 2.1.4 细胞株
• 2.1.5 主要试剂和培养基的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 pFIV-H1/U6-MCP-1 siRNA载体的构建
• 2.2.2 细胞培养
• 2.2.3 细胞转染
• 2.2.4 细胞增殖抑制试验
• 2.2.5 细胞划痕实验
• 2.2.6 Transwell细胞侵袭实验
• 2.2.7 肿瘤细胞凋亡检测
• 2.2.8 RT-PCR
• 2.2.9 Western blot检测细胞MMP-9、VEGF、Caspase-3蛋白
• 2.2.10 酶联免疫吸附试验
• 2.2.11 统计学方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 质粒鉴定
• 2.3.2 细胞增殖抑制试验
• 2.3.3 细胞划痕实验
• 2.3.4 Transwell细胞侵袭实验
• 2.3.5 细胞凋亡检测
• 2.3.6 酶联免疫吸附试验
• 2.3.7 RT-PCR
• 2.3.8 Western blot
• 2.4 讨论
• 第3章 结论
• 参考文献
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果
• 致谢