玉米凝集素性质及其在PGPR筛选中的应用

论文摘要

植物凝集素是一类包含有至少一个能可逆结合单糖或寡糖的非催化区域的糖蛋白。不同凝集素糖结合专一性不同,可特异识别相关微生物,从而表现出植物根部对植物根际微生物的选择作用。本文以玉米种子为材料,分离纯化出玉米凝集素,对其性质进行了研究;以选择性培养基从玉米根际土中初筛得到玉米根际固氮菌、解磷细菌、解钾细菌;利用荧光素标记的玉米凝集素为复筛工具,从玉米根际筛选出了具有玉米凝集素亲和性的固氮菌、解磷细菌和解钾细菌,并对亲和性菌株进行了包括形态学、生理生化和16S rDNA的初步鉴定。玉米种子研磨过筛后,经脱脂、磷酸缓冲液浸提、50%硫酸铵沉淀、PBS平衡透析、冷冻干燥后得玉米凝集素粗品。粗品经过Sephrose 4B层析,得到较纯的玉米凝集素,产率为0.154mg/g玉米,凝集兔血红细胞的最高效价为1:16。对玉米凝集素性质进行研究,发现:1)玉米凝集素具有凝血血型专一性,能够在较低浓度时使兔血红细胞发生凝集,但在任何浓度下都不能使人的A、B、AB、O 4种血型的血红细胞发生凝集;2)玉米凝集素对温度较为敏感,40℃保温10min后,凝集活性与室温相当,50℃稍有降低,而当60℃保温10min后,其凝集活性完全丧失;3)在pH影响试验中,玉米凝集素在pH3.0-10.0的广泛范围内均具活性,在pH8.0-9.0范围内最高,但当pH达到10.0后出现了明显下降;4)EDTA、K+、Ca2+、Mg2+对玉米凝集素的活性没有影响,Fe3+、Mn2+则能够抑制玉米凝集素的凝血活性。采用Marshall法用异硫氰酸荧光素标记玉米凝集素,经测定,标记后玉米凝集素的凝血效价较标记前未发生改变,仍为1:16。以选择性培养基从玉米根际土中初筛得到固氮细菌15株,解磷细菌30株、解钾细菌26株。利用异硫氰酸荧光素标记的玉米凝集素为复筛工具,得到具有玉米凝集素亲和活性菌株共4株,其中,1株固氮菌,2株解磷细菌,1株解钾细菌,分别命名为N12、P07、P23、K19。对这4株细菌进行了形态学观察,并对菌株进行了生理生化及16S rDNA鉴定。经鉴定,N12为固氮菌属（Azotobacter）;解磷菌株P07为芽孢杆菌属（Bacillus）,P23为假单孢菌属（Pseudomonas）;解钾菌株K19为芽孢杆菌属（Bacillus）。随着现代农业的发展,化肥的滥用造成了农田品质恶化、环境污染等一系列严重问题。微生物肥料通过微生物自身的生命代谢活动起效,具有肥效高、成本低、对环境无污染等优点。本文利用荧光素标记的玉米凝集素为复筛工具,筛选出了具玉米凝集素亲和性促生菌株,可做为玉米专用微生物肥料选育的出发菌株。开发微生物肥料,减少化肥用量,能够有效解决化肥过多而导致的环境污染问题,获得良好的生态效应和社会效应。

论文目录

• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 植物凝集素简介
• 1.1.1 植物凝集素的定义
• 1.1.2 植物凝集素的种类
• 1.1.3 植物凝集素的生物学作用
• 1.2 微生物菌肥研究进展
• 1.2.1 PGPR 简介
• 1.2.2 PGPR 的作用机制
• 1.2.3 微生物菌肥的种类
• 1.2.4 微生物菌肥的开发利用现状及发展趋势
• 1.3 植物凝集素在PGPR 筛选中的应用
• 1.3.1 植物凝集素在植物和微生物相互关系中的特异性识别作用
• 1.3.2 植物凝集素在PGPR 筛选中的应用研究现状
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 玉米种子
• 3.1.2 玉米根际土
• 3.1.3 人 A、B、O、AB 血型及兔红细胞
• 3.1.4 实验所用的主要试剂及仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 溶液、培养基及血红细胞悬液的配制
• 3.2.2 玉米凝集素的分离纯化
• 3.2.3 玉米凝集素的性质
• 3.2.4 玉米根际促生细菌的分离
• 3.2.5 具有玉米凝集素亲和性PGPR 的筛选
• 3.2.6 具有玉米凝集素亲和性PGPR 的鉴定
• 4 结果与分析
• 4.1 玉米凝集素的分离纯化
• 4.1.1 玉米凝集素盐析分级范围的确定
• 4.1.2 玉米凝集素的纯化
• 4.2 玉米凝集素的性质
• 4.2.1 玉米凝集素凝血血型专一性测定
• 4.2.2 温度对玉米凝集素凝血活性的影响
• 4.2.3 pH 对玉米凝集素凝血活性的影响
• 4.2.4 金属离子及EDTA 对玉米凝集素凝血活性的影响
• 4.3 玉米专用微生物肥料优良菌株的筛选
• 4.3.1 玉米根际PGPR 的初步筛选
• 4.3.2 具有玉米凝集素亲和性PGPR 的筛选
• 4.4 具有玉米凝集素亲和活性菌株的鉴定
• 4.4.1 菌株的形态学鉴定
• 4.4.2 菌株的生理生化鉴定
• 4.4.3 菌株的16S rDNA 鉴定
• 5 结论与讨论
• 5.1 玉米凝集素的纯化
• 5.2 玉米凝集素的性质
• 5.3 玉米凝集素的荧光标记
• 5.4 玉米根际PGPR 及其与玉米凝集素的相互作用
• 5.5 具有玉米凝集素亲和性PGPR 菌株的鉴定
• 参考文献
• 英文摘要
• 附录 亲和性菌株16S rDNA 序列