论文摘要
细胞凋亡是有关细胞死亡的一种模式,是生物界重要的生命现象之一,而凋亡失衡会导致多种疾病的发生。过度凋亡导致萎缩,凋亡抑制则会导致细胞增殖失控,如癌症。显然,凋亡调控成为凋亡相关疾病的潜在治疗方法。便捷的凋亡监测手段为凋亡相关研究,特别是调控凋亡相关药物筛选方面提供有力支持。细胞质中的Caspase蛋白水解酶,如Caspase-3、caspase-7在调节细胞凋亡过程中起重要作用,因此,针对Caspase蛋白水解酶活性变化,开发快速、便利及可靠的监测方法变得尤为迫切。近年来,出现了一些新的指示Caspases活化的方法。一种是用包含有Caspases剪切序列的FRET技术,这种技术使动态研究单个细胞Caspases活性状态成为现实。然而此技术中荧光改变非常弱,需要精确计算,并受细胞培养环境和形态变化的影响,不能应用于群体细胞凋亡监测和三维克隆细胞培养平台。还有一些方法由荧光素酶发展而来,但这些方法都需要添加荧光素或其衍生物,这些物质会影响细胞的正常培养,一些化合物甚至会导致细胞实验的终止,而且这些方法也很难应用于连续的细胞凋亡监测和单个细胞的凋亡监测。因此,实验以荧光蛋白Venus的空间结构及BiFC为基础,通过调整荧光蛋白Venus的空间结构,插入蛋白水解酶Caspase-3的识别序列,连接高效反式剪切内含肽NpuDnaE,开发出一种循环置换荧光融合蛋白。一旦细胞启动凋亡程序,活化的Caspase-3作用于此工具,此工具就会迅速出现荧光。实验证明此细胞凋亡可视化工具有诸多优势:荧光持续时间长,达48h以上;对Caspase-3样蛋白水解酶活性变化具有高度特异性;实现群体细胞中单个细胞的凋亡监测;可应用于细胞凋亡的早期、实时监测;能够应用于三维细胞培养平台;能够应用于高通量筛选平台;能够与其他荧光报道工具联合应用于实验研究中。另外,通过对不同荧光蛋白的探索,实验还成功将Cerulean、sfGFP和mCherry等不同颜色的荧光蛋白应用于此细胞凋亡可视化工具中,拓宽了应用范围。与FRET及BiFC技术不同,基于荧光有无变化的Caspase-3样蛋白水解酶活性指示工具开创了荧光蛋白在分子技术领域的新应用,这一技术还可以推广到体内外其它蛋白水解酶活性的监测。然而其中间插入令荧光蛋白功能失活的序列长度有一定限制,使得此工具的应用依赖于特定的蛋白水解酶,如识别序列长度和作用位点结构。