食用菌产植酸酶菌株的筛选及植酸酶基因的克隆研究

论文摘要

植酸酶（Phytase）是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸的一类酶的总称。植酸酶添加在饲料中,会将其中的植酸水解成肌醇和磷酸,从而提高了磷的利用率,降低了粪便中磷的排放量,减少了植酸磷对环境的污染。更为重要的是,植酸酶可使植酸盐蛋白质复合物降解从而提高蛋白质的利用率,减少植酸盐对微量元素的螯合,提高饲料的营养价值。此外,植酸酶制剂在食品、医药等方面有广泛的应用。所以,植酸酶作为一种饲料添加剂,有着广阔的应用前景。植酸酶的研究现已成为世界性的研究热点之一。 尽管植酸酶的基因工程研究已有近十年的历史,但目前在饲料工业中还没有能够得到很好的推广利用,其最主要的原因是生产菌株的表达水平较低、植酸酶必须耐受工业生产中制粒过程的高温和动物消化道的低pH值。要想获得能满足符合生产要求的植酸酶,寻求优良基因源,通过基因工程手段,使多种有利特性集中到一株酶上,无疑是解决这一问题之有效途径之一。本研究所克隆的植酸酶基因不仅为植酸酶进一步在各种微生物、植物中表达提供了优良的基因源,而且弥补了食用菌中克隆植酸酶基因的空白。 采用透明圈筛选法从21株食用菌菌株中筛选出3株高产植酸酶菌株—金针菇1号、平菇1号和平菇2号。再根据GenBank中其他物种的植酸酶基因的保守区设计7条特异性引物,以金针菇1号、平菇1号和平菇2号菌丝的总DNA为模板,通过PCR扩增,分别获得了长约789bp、919bp和622bp的目的片段。Blastx分析结果表明:Fla1目的基因区域与来源于Agrocybe pediades植酸酶基因（GenBank Accession:CAC48160）氨基酸序列同源性最高,为50%;Ple1目的基因区域和Ple2目的基因区域与来源于Trametes pubescens植酸酶基因（GenBankAccession:CAC48234）氨基酸序列同源性最高,分别为64%和47%。 再根据Ple2目的基因区域的序列设计嵌套引物,采用TAIL-PCR技术克隆平菇2号植酸酶基因区域两端的未知侧翼序列,经序列测定,得到长为1290bp的目的序列。经分析,该序列共编码387个氨基酸,在282～394bp处含有一个典型的真菌内含子序列:供体序列（donor）GTACGT和受体序列（accepter）CAG。G+C含量达54%,而密码子第三位碱基的G+C含量高达52.25%,正电荷氨基酸残基（Arg+Lys）有33个,负电荷氨基

论文目录

• 1 前言
• 1.1 植酸酶的研究进展
• 1.1.1 植酸酶的作用机理
• 1.1.2 植酸酶的来源
• 1.1.2.1 植物植酸酶的来源
• 1.1.2.2 动物植酸酶的来源
• 1.1.2.3 微生物植酸酶的来源
• 1.1.3 植酸酶的特性
• 1.1.4 植酸酶的功能
• 1.1.4.1 提高磷的吸收，降低磷的排泄
• 1.1.4.2 提高微量元素的吸收
• 1.1.4.3 提高蛋白质的利用率
• 1.1.5 植酸酶的应用
• 1.1.5.1 植酸酶在鱼用饲料中的应用意义
• 1.1.5.2 植酸酶在蛋鸡和肉鸡生产上的应用
• 1.1.5.3 植酸酶在食品中的应用
• 1.1.5.4 植酸酶在化工医药产品开发研究中的应用
• 1.1.6 植酸酶高产菌株的研究进展
• 1.1.7 植酸酶的基因工程研究进展
• 1.1.7.1 利用微生物反应器高效表达植酸酶基因的研究进展
• 1.1.7.2 利用动物反应器高效表达植酸酶基因的研究进展
• 1.1.7.3 利用植物反应器高效表达植酸酶基因的研究进展
• 1.2 TAIL-PCR研究进展
• 1.2.1 TAIL-PCR技术的原理
• 1.2.2 TAIL-PCR技术优点、难点以及对策
• 1.2.2.1 AD引物的优化设计
• 1.2.2.2 AD池的建立
• 1.2.2.3 AD随机简并引物与不同酶组合
• 1.2.2.4 PCR产物经连接转化、鉴定、测序
• 1.2.2.5 第三轮PCR中采用改进的13个TAIL-PCR循环
• 1.3 本研究的目的意义
• 1.4 技术路线
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料、试剂与仪器
• 2.1.1 实验材料及试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 食用菌产植酸酶菌株的筛选
• 2.2.2 金针菇Fla1植酸酶基因区域的克隆
• 2.2.2.1 菌丝体的培养与收集
• 2.2.2.2 DNA提取
• 2.2.2.3 引物的设计与合成
• 2.2.2.4 反应体系
• 2.2.2.5 反应程序
• 2.2.2.6 PCR产物的回收
• 2.2.2.7 PCR产物与T载体连接
• 2.2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.2.9 PCR连接产物的转化
• 2.2.2.10 重组质粒的提取
• 2.2.2.11 重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.3 平菇Ple1植酸酶基因区域的克隆
• 2.2.3.1 菌丝体的培养与收集及DNA提取
• 2.2.3.2 引物的设计与合成
• 2.2.3.3 反应体系
• 2.2.3.4 反应程序
• 2.2.3.7 重组质粒的提取及鉴定
• 2.2.4 平菇2号（Ple2）植酸酶基因区域的克隆
• 2.2.4.1 菌丝体的培养与收集及DNA提取
• 2.2.4.2 引物的设计与合成
• 2.2.4.3 反应体系
• 2.2.4.4 反应程序
• 2.2.4.5 PCR产物的回收及连接
• 2.2.4.6 大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的提取及鉴定
• 2.2.5 平菇ple2植酸酶基因区域的未知侧翼序列的克隆
• 2.2.5.1 引物的设计
• 2.2.5.1.1 简并引物设计
• 2.2.5.1.2 特异性引物的设计
• 2.2.5.2 平菇2号植酸酶基因区域的未知侧翼序列的TAIL-PCR扩增
• 2.2.5.3 PCR产物的回收及连接
• 2.2.5.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.5.5 重组质粒的提取及鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 食用菌产植酸酶菌株的筛选
• 3.2 金针菇Fla1植酸酶基因区域的克隆
• 3.2.1 Fla1植酸酶基因区域的PCR扩增
• 3.2.2 酶切鉴定
• 3.2.3 序列测定及分析
• 3.2.3.1 测序结果
• 3.2.3.2 序列分析
• 3.3 平菇Ple1植酸酶基因区域的克隆
• 3.3.1 Ple1植酸酶基因区域的PCR扩增
• 3.3.2 酶切鉴定
• 3.3.3 序列与分析
• 3.3.3.1 测序结果
• 3.3.3.2 序列分析
• 3.4 平菇2号（Ple2）植酸酶基因的克隆
• 3.4.1 Ple2植酸酶基因区域的PCR扩增
• 3.4.2 酶切鉴定
• 3.4.3 序列与分析
• 3.4.3.1 测序结果
• 3.4.3.2 序列分析
• 3.5 平菇Ple2phy的未知侧翼序列的克隆
• 3.5.1 3’端和5’端的TAIL-PCR扩增
• 3.5.2 质粒pGT ple2phy2和pGT ple2phy3的酶切鉴定
• 3.5.3 Ple2植酸酶基因3’端和5’端的序列测定及分析
• 4 讨论
• 4.1 植酸酶基因的获得
• 4.2 序列比较分析
• 5 结论
• 参考文献
• 缩写词（Abbreviation）
• 附录：测序图
• 致谢