白蚁内切-β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆、表达及分子改造

论文摘要

纤维素（Cellulose）是地球上最丰富的有机物质,它是光合作用最主要的产物,同时也是最丰富的可再生资源,地球上每年光合作用可产生大于100亿吨的植物干物质,其中一半以上是纤维素和半纤维素。但纤维素的利用目前尚未完全开发,随着地球石化能源短缺和枯竭的日趋严峻,人类把眼光转向了对纤维素的利用,利用纤维素酶将纤维素降解为可发酵的单糖,进而发酵生产乙醇。然而目前发现的纤维素酶都存在活力低和反应速度慢的缺点,因此寻找新的或者通过改造现有的纤维素酶基因获得活力更高纤维素酶是解决纤维素开发利用的关键问题。本研究提取了台湾家白蚁总RNA通过RT-PCR扩增出白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶基因,并分别构建了表达内切-β-1,4-葡聚糖酶的大肠杆菌和酿酒酵母表达载体。利用金属镍亲和层析对大肠杆菌表达的内切-β-1,4-葡聚糖酶进行纯化,CMC酶活检测显示纯化酶的最适温度和最适pH值分别为42℃、6.5;内切-β-1,4-葡聚糖酶的Vmax为0.071mg/ml*min,Km值为80.2712mg/ml,比活力为13.544U/mg。利用定点突变对白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶基因进行改造,首先是借助计算机根据白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶的同源建模三维结构信息,利用ProSA2003软件根据能量（knowledge-based potentials）最低化原则,计算机辅助设计确定白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶氨基酸饱和突变位点,通过同源建模分析表明53D、56D和411E三个位点都是活性中心位点。利用兼并引物对53,56,411位点的氨基酸分别进行饱和突变,筛选到三个有活力的突变子C53、E53和C56。对突变酶进行酶学性质的研究表明,C53的最适温度、最适pH、米氏常数、Vmax和比活力分别为42℃、6.5、37.683 mg/mL、0.0334umol/mL*min、9.912 U/mg;突变酶E53的最适温度、最适pH、米氏常数、Vmax和比活力分别为37℃、6.5、93.819mg/mL、0.124umol/mL*min、16.421U/mg;突变酶C56的最适温度、最适pH、米氏常数、Vmax和比活力分别为42℃、8.0、26.809mg/mL、0.0324umol/mL*min、16.470U/mg。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 纤维素
• 1.2 纤维素酶
• 1.2.1 纤维素酶的分类及作用机制
• 1.2.2 纤维素酶的分子结构
• 1.2.3 纤维素酶的催化机制及理化性质
• 1.2.3.1 纤维素酶的催化机制
• 1.2.3.2 纤维素酶的理化性质
• 1.2.4 纤维素酶的来源
• 1.2.4.1 来源于微生物的纤维素酶
• 1.2.4.2 来源于动物的纤维素酶
• 1.3 纤维素酶的克隆与表达
• 1.4 白蚁内源纤维素酶研究进展
• 1.5 纤维素酶的分子进化
• 1.5.1 酶分子进化策略
• 1.5.2 纤维素酶分子进化研究进展
• 1.6 本论文研究的意义
• 1.6.1 研究白蚁纤维素酶的意义
• 1.6.2 在大肠杆菌和酿酒酵母中表达纤维素酶的研究意义
• 1.6.3 本论文研究的意义
• 1.7 技术路线
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 白蚁、菌株与质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 酶与试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 方法与步骤
• 2.2.1 白蚁总RNA的提取以及cDNA的获得
• 2.2.2 白蚁内切纤维素酶基因的鉴定
• 2.2.3 引物设计及PCR扩增
• 2.2.3.1 引物设计
• 2.2.3.2 PCR扩增
• 2.2.4 表达载体的构建
• 2.2.4.1 目的基因大肠杆菌表达载体的构建
• 2.2.4.2 目的基因酿酒酵母表达载体的构建
• 2.2.5 大肠杆菌感受态的制备
• 2.2.6 大肠杆菌质粒DNA的大量制备（参考文献,略有修改）
• 2.2.7 大肠杆菌质粒DNA的小量制备（参考文献,略有修改）
• 2.2.8 酵母感受态的制备（参照文献,略有修改）
• 2.2.9 酿酒酵母质粒的提取
• 2.2.10 DNA的酶切与连接
• 2.2.11 连接产物化学转化大肠杆菌感受态细胞（参照文献）
• 2.2.12 质粒DNA化学转化酿酒酵母（采用LiAc/SS-DNA/PEG法）
• 2.2.13 阳性克隆的筛选和酶切验证
• 2.2.14 外源片段在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.2.14.1 pSE380-EG转化子的刚果红染色
• 2.2.14.2 转化子的诱导表达
• 2.2.14.3 粗酶液的制备
• 2.2.14.4 包涵体的检测
• 2.2.15 外源基因在酵母中的诱导表达
• 2.2.15.1 pYES2—EG转化子的刚果红染色
• 2.2.15.2 酵母转化子的诱导表达
• 2.2.16 表达产物的变性SDS-PAGE电泳
• 2.2.17 酶的纯化
• 2.2.18 蛋白含量测定
• 2.2.19 酶活的测定
• 2.2.19.1 酶活的测定原理
• 2.2.19.2 酶活测定步骤
• 2.2.19.3 葡萄糖标准曲线的测定
• 2.2.19.4 酶活定义
• 2.2.19.5 酶活力计算
• 2.2.20 白蚁内切纤维素酶酶学性质测定
• 2.2.21 白蚁内切纤维素酶分子理性设计试验方法
• 2.2.21.1 饱和突变点的选择
• 2.2.21.2 饱和突变方法—一步反向PCR法
• 2.2.21.3 白蚁内切纤维素酶基因饱和突变PCR引物设计
• 2.2.21.4 饱和突变的PCR扩增
• 2.2.21.5 白蚁内切纤维素酶基因饱和突变文库的构建与筛选
• 2.2.21.6 饱和突变酶的基因测序及序列分析
• 2.2.21.7 饱和突变酶的酶学性质测定
• 第三章 结果和分析
• 3.1 白蚁内切纤维素酶基因的鉴定
• 3.1.1 白蚁内切纤维素酶基因的获得与测序
• 3.1.2 白蚁内切纤维素酶基因的序列分析
• 3.2 白蚁内切纤维素酶在大肠杆菌中的表达
• 3.2.1 白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶基因（EG）与表达载体pSE380的连接
• 3.2.2 转化子的平板筛选
• 3.2.3 白蚁内切纤维素酶基因的表达、纯化及SDS-PAGE电泳
• 3.2.4 白蚁内切纤维素酶酶学性质的研究
• 3.2.4.1 温度和pH值对白蚁内切纤维素酶酶活的影响
• 3.2.4.2 Km值及Vmax的测定
• 3.3 白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶在酿酒酵母中的表达
• 3.3.1 转化子的平板筛选
• 3.3.2 酿酒酵母转化子诱导时间的确定
• 3.4 白蚁内切纤维素酶的分子改性
• 3.4.1 白蚁内切纤维素酶基因突变位点的选择
• 3.4.2 白蚁内切纤维素酶基因定点突变PCR
• 3.4.3 突变体的获得及序列分析
• 3.4.4 突变型EG的纯化及SDS-PAGE分析
• 3.4.5 野生酶及突变酶的酶学性质比较
• 3.4.5.1 最适温度和最适pH的比较
• 3.4.5.2 Km值、Vmax及比活力的比较
• 第四章 讨论
• 4.1 重组质粒pYES2-EG在酿酒酵母中表达CMCase活力低的原因
• 4.2 白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶基因的定点突变
• 4.2.1 突变点的确定
• 4.2.2 突变点的分析
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 问题与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文