有机磷农药荧光偏振及多残留免疫分析研究

论文摘要

本文以研究建立快速检测环境中有机磷农药残留的荧光偏振免疫（FPIA）分析方法和多残留酶联免疫（ELISA）分析方法为目标,设计合成了三种不同类结构的有机磷农药通用人工半抗原,并通过结合载体蛋白免疫动物获得了三种分别抗二乙氧基磷酸基、含芳环（或杂环）硫代磷酸基以及二乙氧基硫代磷酸并具一直链芳烃的有机磷农药的群特异性抗体。在所获得抗体的基础上,研究确立了二种检测有机磷农药的FPIA分析方法以及三种有机磷农药多残留ELISA分析方法。所建立的方法为有机磷农药的快速多残留检测提供了技术手段,并具一定的使用价值和推广应用前景。主要研究结果如下:1.确立二乙氧基磷乙酸（DEP）作为二乙氧基磷酸基团的有机磷农药的通用半抗原,采用活性酯法制备人工免疫原（DEP-BSA）,同时将DEP结合OVA得到包被原（DEP-OVA）。通过免疫动物获得三种抗二乙氧基磷酸酯类有机磷农药的抗血清,分别为抗血清A、B、D。三种抗血清效价测定结果分别为1︰10000,1︰5000和1︰20000。以抗血清D研究有机磷农药ELISA检测方法,确立最佳ELISA分析条件为:包被原浓度2μg/mL,Costar的酶标板中4℃包被过夜,抗血清的工作稀释度是1︰20000,抗原抗体的最佳反应pH为7.0。亲和性测定结果表明,其对二乙氧基磷酸基有机磷农药有较高的亲和性,在此基础上建立了此类有机磷农药的多残留间接竞争ELISA方法,方法对对硫磷、嘧啶磷及敌敌畏三种农药在0.0110μg/mL浓度之间具有良好的检测效果,最小检测限分别为12.5 ng/mL,11.6 ng/mL和48.3 ng/mL。该方法对水样中对硫磷、嘧啶磷以及敌敌畏的添加平均回收率为106.0%110.0%。2.应用上述抗对硫磷抗体A和抗体D以及荧光标记物PM-B-EDF,研究确立了检测对硫磷的FPIA分析方法。该方法对对硫磷的检测范围为0.1μg/mL100μg/mL。检测水样中的对硫磷,平均回收率为104.0%108.3%,最小检测限为0.18μg/mL。应用抗甲基谷硫磷抗体MAb-Azi-110以及荧光标记物MBP-EDF 2,研究确立了检测甲基谷硫磷的FPIA分析方法。该方法对甲基谷硫磷的检测范围为0.110μg/mL。检测水样中的甲基谷硫磷,平均回收率为96.1%120.0%,最小检测限为0.148μg/mL。3.研究合成了含芳环（或杂环）硫代有机磷农药的通用人工半抗原ArOP,通过重氮化法结合BSA获人工免疫原ArOP-BSA,免疫动物获得三种抗芳环（或杂环）硫代类有机磷农药的群特异性抗血清1、2、3,三种抗血清的效价分别为1︰40000、1︰80000和1︰40000。抗血清的亲和性测定结果表明,其对芳环（或杂环）硫代有机磷农药具有高度的亲和性。以抗血清2建立的用于检测此类有机磷农药的多残留间接竞争ELISA分析方法,该方法对对硫磷及二嗪磷的检测范围为0.05μg/mL10μg/mL,最小检测限分别为0.023μg/mL和0.029μg/mL对水中的对硫磷及二嗪磷检测,添加回收率为96.0%106.4%。4.通过结合O,O-二乙基硫代磷酰氯和4-氨基丁酸合成二乙氧基硫代磷酸基团并具一直链芳烃的有机磷农药的通用人工半抗原DENP,采用碳二亚胺法结合BSA获得免疫原DENP-BSA,免疫动物获得该类有机磷农药的群特异性抗血清,其效价为1︰50000。抗血清的亲和性测定结果表明,其对二乙氧基硫代磷酸基团并具一直链芳烃的有机磷农药具有高度的亲和性。所建立用于检测此类有机磷农药多残留间接竞争ELISA分析方法,对内吸磷和甲拌磷的检测范围为0.01μg/mL100μg/mL,最小检测限分别为0.043μg/mL和0.019μg/mL。对水中的内吸磷和甲拌磷检测,添加回收率为108.0%112.0%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1. 农药残留对环境的影响
• 1.1 农药残留对水体的影响
• 1.2 农药残留对土壤的影响
• 1.3 农药残留对大气的影响
• 1.4 农药残留对人体健康的影响
• 1.5 农药残留对生物的影响
• 2. 农药残留免疫检测技术
• 2.1 农药人工抗原制备
• 2.2 农药抗体制备
• 2.3 酶联免疫分析
• 3. 荧光偏振免疫分析方法及在农药残留上的应用
• 3.1 荧光偏振的原理
• 3.2 FPIA 的原理
• 3.3 荧光偏振免疫分析类型
• 3.4 FPIA 定量分析（标准曲线）
• 3.5 FPIA 方法的优点和缺点
• 3.6 FPIA 方法在农药残留检测中的应用
• 第二章 研究背景、意义、内容及技术路线
• 1. 研究背景及意义
• 2. 研究内容
• 2.1 有机磷农药ELISA 分析方法的建立
• 2.2 有机磷农药荧光偏振免疫分析方法的建立
• 3. 技术路线
• 第三章 直链有机磷农药多残留酶联免疫分析研究
• 1. 引言
• 2. 材料与方法
• 2.1 试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 实验动物
• 2.4 实验方法
• 3. 结果与分析
• 3.1 人工免疫原的合成与判定
• 3.2 抗血清的获得及效价测定
• 3.3 间接竞争ELISA 方法的确立
• 3.4 水样中对硫磷、嘧啶磷及敌敌畏的ELISA 检测
• 4. 小结
• 第四章 有机磷农药荧光偏振免疫分析研究
• 1. 引言
• 2. 材料与方法
• 2.1 试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 方法
• 3. 结果与分析
• 3.1 荧光标记物的制备
• 3.2 荧光标记物使用浓度的确立
• 3.3 抗体稀释曲线
• 3.4 对硫磷及甲基谷硫磷的标准曲线
• 3.5 水样的添加回收率
• 4. 小结
• 第五章 含环有机磷农药多残留酶联免疫分析研究
• 1. 引言
• 2. 材料与方法
• 2.1 试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 实验动物
• 2.4 实验方法
• 3. 结果与分析
• 3.1 半抗原结构分析
• 3.2 人工免疫原的合成与判定
• 3.3 抗血清的获得及效价测定
• 3.4 抗体的亲和性考察
• 3.5 间接ELISA 分析方法的建立
• 3.6 水样中对硫磷和二嗪磷的ELISA 检测
• 4. 小结
• 第六章 硫代直链有机磷农药多残留酶联免疫分析研究
• 1. 引言
• 2. 材料与方法
• 2.1 试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 实验动物
• 2.4 实验方法
• 3. 结果与分析
• 3.1 半抗原的结构分析
• 3.2 人工免疫原的合成与判定
• 3.3 灰化定磷含量计算偶联比
• 3.4 抗血清的获得及效价测定
• 3.5 抗体的亲和性考察
• 3.6 间接竞争ELISA 方法的确立
• 3.7 水样中内吸磷和甲拌磷的ELISA 检测
• 4. 小结
• 第七章 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的论文、申请的专利及获奖