论文摘要
2型糖尿病已经成为全球范围的流行性疾病。其患病率和发病率无论在发达国家或发展中国家都迅速增长,故如何改善胰岛素抵抗和β细胞功能一直是研究的热点。脂代谢紊乱与2型糖尿病之间关系已越来越受到大家的重视。游离脂肪酸不仅参与了胰岛素抵抗的发生,也损害了β细胞的胰岛素分泌功能,导致β细胞凋亡,并与2型糖尿病发病密切相关。研究脂毒性与β细胞凋亡的关系有重要意义。近年来动物实验研究发现SIRT1对哺乳动物β细胞的胰岛素分泌有正向调节作用,改善胰岛素抵抗,并能抑制多种细胞的凋亡。而SIRT1能否改善脂毒性引起的β细胞的凋亡以及SIRT1是否与2型糖尿病患者体重指数、血糖、血浆胰岛素、血脂和胰岛素抵抗指数等相关未见研究报道。基于上述的基础,我们进行了下列实验:第一部分SIRT1在游离脂肪酸诱导胰岛INS-1细胞凋亡中变化的研究目的:通过观察游离脂肪酸（FFA）对INS-1细胞SIRT1水平、活性氧簇（ROS）水平和凋亡的影响,初步探讨FFA损害β细胞功能的机制及SIRT1的变化情况。实验方法:1、培养大鼠胰岛瘤细胞系INS-1,传代。2、培养大鼠胰岛瘤细胞系INS-1,确定游离脂肪酸作用的时间与浓度。3、培养大鼠胰岛瘤细胞系INS-1,分别用含500μmol/l的FFA和500μmol/l的BSA培养INS-1细胞36小时,观察SIRT1mRNA表达水平。4、培养大鼠胰岛瘤细胞系INS-1,分别用含500μmol/l的FFA和500μmol/l的BSA培养INS-1细胞36小时,观察ROS表达水平。5、培养大鼠胰岛瘤细胞系INS-1,分别用含500μmol/l的FFA和500μmol/l的BSA培养INS-1细胞36小时,观察凋亡情况。结果:1、INS-1细胞的生存率随着FFA作用时间的增加而逐渐降低,同时INS-1细胞的生存率随着FFA的作用浓度的增加而降低。在后续的实验中取的最适宜的FFA的作用时间和浓度分别为36小时和500μmol/l。2、INS-1在含有500μmol/l的FFA培养36小时,SIRT1mRNA相对表达量（0.50±0.12）较BSA组（1.02±0.08）明显下降（P<0.01）。3、INS-1在含有500μmol/l的FFA培养36小时,ROS水平较BSA组明显增高（437.88±130.38 vs 136.38±55.23, P<0.01）。4、INS-1在含有500μmol/l的FFA培养36小时,凋亡水平较BSA组明显增高（35.92±7.81 vs 5.53±1.76, P<0.01）。结论:FFA能促进ISN-1细胞凋亡,其促凋亡作用与高脂毒性产生的氧化应激有关,同时,高脂条件下,ISN-1细胞SIRT1表达下降。结果提示在高脂条件下ISN-1细胞的凋亡与SIRT1有关。第二部分SIRT1抗胰岛INS-1细胞凋亡作用研究目的:构建SIRT1过表达质粒及对照质粒,转染于INS-1细胞,观察游离脂肪酸对转染质粒的INS-1细胞ROS和凋亡的影响,探讨SIRT1在FFA损害β细胞功能中的保护作用。实验方法:1、培养大鼠胰岛瘤细胞系INS-1,传代。2、构建SIRT1过表达质粒及对照质粒。3、用FuGENE HD把SIRT1过表达质粒及对照质粒转染于INS-1细胞,检测转染效果。4、培养转染有SIRT1过表达质粒、对照质粒及未转染质粒的INS-1细胞,用含500μmol/l的FFA培养上述各组INS-1细胞36小时,观察ROS表达水平。5、培养转染有SIRT1过表达质粒、对照质粒及未转染质粒的INS-1细胞,用含500μmol/l的FFA培养上述各组INS-1细胞36小时,观察凋亡情况。结果:1、INS-1转染SIRT1过表达质粒48小时,SIRT1mRNA相对表达量（7.74±1.68）较转染对照质粒组（1.03±0.17）明显增高（P<0.01）。2、过表达SIRT1的INS-1细胞在含有500μmol/l的FFA培养36小时,ROS水平较未转染组和对照质粒组明显下降（ 284.80±87.97 vs 458.15±134.94 and 437.45±110.38, P<0.01）,而未转染组和对照质粒组在FFA作用下ROS水平无统计学差异（458.15±134.94 vs 437.79±110.38, P>0.05）。3、过表达SIRT1的INS-1细胞在含有500μmol/l的FFA培养36小时,凋亡水平较未转染组和对照质粒组明显下降（18.72±7.13 vs 36.55±8.16 and 34.42±7.36, P<0.01）,而未转染组和对照质粒组在FFA作用下凋亡水平无统计学差异（36.55±8.16 vs 34.42±7.36,P>0.05）。结论:FFA能促进ISN-1细胞凋亡,其促凋亡作用与高脂毒性产生的氧化应激有关,而ISN-1细胞过表达SIRT1可明显抑制氧化应激的产生,减少高脂状态下ISN-1细胞的凋亡,结果提示在高脂条件下SIRT1对ISN-1细胞有保护作用,其减少凋亡的机制与抗氧化应激有关。第三部分SIRT1mRNA在初诊2型糖尿病患者脂肪组织的表达及意义目的:探讨初诊2型糖尿病（T2DM）患者脂肪组织SIRT1mRNA表达水平及其与体重指数（BMI）、腰臀比（WHR）、血糖、血浆胰岛素、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）关系。实验方法:1、测身高、体重、腰围和臀围:计算体重指数BMI=体重（kg）/身高（m）2。腰臀比WHR=腰围（cm）/臀围)（cm）。2、标本收集:取患者及对照者空腹静脉血,测定血脂、血糖、胰岛素。患者及对照者于手术时取腹部脂肪组织,检测SIRT1mRNA水平。3、空腹血浆葡萄糖（ FBG）和空腹血胰岛素（ FINS）:葡萄糖采用葡萄糖氧化酶法测定,胰岛素用放免法测定。按稳态模式评估法计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR = FINS×FPG/22.5）。4、PT-PCR检测SIRT1mRNA。结果:1、临床及生化特征比较:两组间年龄、性别、TC、LDL、HDL和WHR均无明显差异性。2型糖尿病组患者BMI、HbA1c、FBG、FINS、HOMA-IR、TG均高于对照组（P<0.01和P<0.05）,SIRT1则低于对照组（P<0.01）。2、相关性分析:线性相关分析表明,SIRT1与FINS、HOMA-IR呈明显负相关（r=-0.421,P<0.01和r=-0.511,P<0.01）。以SIRT1为因变量,年龄、WHR、BMI、TG、TC、LDL、HDL、HbA1c、FBG、FINS和HOMA-IR为自变量,进行多元线性逐步回归分析,结果表明HOMA-IR是影响SIRT1的独立相关因素,回归方程为:Y=1.697-0.103XHOMA-IR。二项Logistic回归分析表明控制性别、年龄、WHR、BMI、TC、TG、HDL、LDL后,发现SIRT1与2型糖尿病发病呈负相关,OR<1。结论:初诊的2型糖尿病患者SIRT1水平明显低于正常对照。SIRT1水平与FINS和HOMA-IR呈明显负相关。以SIRT1为应变量,其它指标为自变量,进行多元线性逐步回归分析,结果表明HOMA-IR是影响SIRT1的独立相关因素。二项Logistic回归分析表明SIRT1与2型糖尿病发病呈负相关。结果提示SIRT1与糖代谢紊乱和胰岛素抵抗有重要的关系,SIRT1是2型糖尿病的保护性因子。