FSH对子宫内膜的影响和调控机制

论文摘要

第一部分FSH促排卵对人子宫内膜AQPs和容受因子的影响目的：验证FSHR在人子宫内膜组织和内膜细胞系Ishikawa细胞的表达,探讨FSH促排卵对人子宫内膜形态、FSHR、AQPs和内膜容受因子表达的影响。材料与方法：收集促排卵（COS）妇女着床窗期子宫内膜15例、同期对照内膜40例,采用化学发光法检测血清FSH和E2水平；采用RT-PCR产物纯化克隆测序、蛋白免疫印记、免疫组织化学、细胞免疫荧光等方法全面验证人子宫内膜组织和细胞FSHR的表达。电镜观察两组子宫内膜形态和超微结构；蛋白免疫印记方法检测两组子宫内膜FSHR、水通道蛋白（AQP1、AQP2、AQP8）、内膜容受因子（Integrinβ3、LIF）、细胞紧密连接相关蛋白（Claudin4）的表达与改变。结果：人子宫内膜组织和子宫内膜细胞系Ishikawa细胞表达FSHR mRNA和蛋白,RT-PCR产物序列与NCBI数据库BLAST比对吻合率100%；蛋白表达主要定位于细胞膜和细胞浆COS妇女血清FSH和E2水平显著高于对照组。扫描电镜下见对照组内膜腔上皮排列有序、胞饮突形成,COS组内膜腔上皮细胞排列分布紊乱、未见明显胞饮突；透视电镜见COS组内膜上皮细胞凋亡增加,细胞紧密连接未见明显改变。COS组内膜组织FSHR蛋白表达显著上调,AQP1、AQP2、AQP8、Integrinβ3、LIF蛋白表达显著下调,Claudin4表达无显著改变。结论：FSHR表达于人子宫内膜组织和子宫内膜细胞系Ishikawa细胞。促排卵妇女血清FSH和E显著升高,内膜FSHR表达上调、AQP1、AQP2、AQP8、Integrinβ3、LIF蛋白表达下调,并致内膜腔上皮形态改变、凋亡增加。FSH可能通过FSHR直接调节育龄期子宫内膜形态和功能。第二部分FSH影响育龄期子宫内膜容受性的调控机制目的：以动物模型和体外模型为基础,研究FSH对育龄期子宫内膜容受性、胚胎着床的影响及可能机制。材料与方法：建立FSH促排卵小鼠动物模型,检测外源性FSH刺激对小鼠血FSH/E2水平、子宫内膜AQPs和着床容受因子、妊娠率和活产率的影响,创新性建立小鼠囊胚粘附模型、检测FSH/E2、PCMB （AQP抑制剂）预处理子宫内膜细胞对囊胚粘附着床的影响；同时进行体外细胞实验,采用RT-Real time PCR检测FSH/E2对AQPs、integrinB3、LIF等容受因子目的基因表达水平；采用ssiRNA干扰技术和JAr滋养细胞球粘附模型,检测AQP2/AQP8siRNA干扰后内膜容受因子的表达改变和JAr滋养细胞球粘附率的改变。结果：FSH促排卵组小鼠血FSH/E2水平显著增高,内膜AQP3、AQP2蛋白表达呈下调趋势、FSHR呈微弱上调趋势,妊娠率和活产率显著低于对照组。小鼠囊胚粘附模型实验显示,体外FSH、FSH/E及PCMB预处理子宫内膜细胞均导致囊胚48h和72h粘附率显著下降。E2对IK细胞AQP2和AQP8 mRNA呈浓度依赖性上调作用,FSH （0、1、3、10、30 IU/L）对IK细胞AQP2、AQP8和LIF mRNA呈浓度依赖性和时间依赖性下调作用,其中以10IU/L和301U/L浓度FSH在作用48hr时的下调作用最为显著。AQP2siRNA干扰后IK细胞着床因子LIF和Integrinβ3表达显著下调,OLFM1表达显著上调；AQP8siRNA干扰后LIF表达显著下调,OLFM1表达显著上调。子宫内膜细胞AQP8siRNA和AQP2siRNA干扰后,JAr滋养细胞团粘附率均显著下降。结论：超生理水平FSH通过下调育龄期子宫内膜AQPs、干扰内膜容受因子表达,进而影响子宫内膜对胚胎的容受性、不利于胚胎着床。第三部分长期高FSH刺激对围绝经期子宫内膜萎缩的影响目的：通过在体组织、动物模型和体外细胞模型,探讨绝经后高FSH水平在子宫内膜功能及萎缩中所起的作用及其机制。材料与方法：采用化学发光法检测围绝经期和绝经后不同年龄段妇女血清FSH、LH、E2变化动态,免疫组织化学方法检测绝经后妇女和育龄期妇女子宫内膜FSHR、Ki67、AQP1、AQP2、AQP8蛋白表达。采用MTT法检测FSH对人原代培养子宫内膜腺上皮细胞和Ishikawa细胞增殖的影响,流式细胞仪检测FSH对Ishikawa细胞周期的影响,Real time PCR检测高浓度FSH对子宫内膜细胞AQP2和AQP8表达的影响、并检测AC激动剂和拮抗剂对FSH作用的影响。建立手术去势动物模型、药物去势动物模型和假手术（对照）动物模型,通过RIA方法检测血FSH和E2水平,采用透视电镜观察子宫内膜细胞形态和凋亡指征、Western blotting检测子宫内膜增殖和凋亡相关指标。结果：绝经后妇女血清FSH水平随年龄从41-50岁年龄段到61-70年龄段呈逐步上升,从61-70年龄段到71-80年龄段无显著上升。血清E2水平呈现与FSH同步的反向变化。与育龄期内膜相比,绝经后子宫内膜FSHR、AQP2和AQP1蛋白表达无显著改变,Ki67表达显著下降, AQP8蛋白间质表达较育龄期增高、腺体表达较育龄期降低。FSH对原代子宫内膜腺上皮细胞呈浓度依赖性的抑制增殖作用,但对Ishikawa细胞增殖和细胞周期无明显影响。高浓度FSH（50IU/L、100IU/L、200IU/L、400IU/L）呈浓度依赖性显著上调Ishikawa细胞AQP2 mRNA的表达,该上调作用可部分被SQ22536所拮抗。Forskolin可上调Ishikawa细胞AQP2 mRNA的表达。动物模型实验方面,成功建立了手术去势（OVX,高FSH、低E2）、药物去势（GnRHa,低FSH、低E2）和假手术对照组（SHAM, FSH和E2水平如常）小鼠。OVX组小鼠子宫萎缩明显、透视电镜下见大片凋亡细胞和散在凋亡小体,而GnRHa组小鼠子宫大小、萎缩度及细胞凋亡现象介于SHAM组和OVX组之间。与SHAM组相比,GnRHa组小鼠子宫C-FOS、C-JUN、Bcl-2蛋白表达量呈下降趋势。与SHAM组和GnRHa组相比,OVX组小鼠子宫C-FOS、C-JUN、Bcl-2蛋白表达显著下降,而Caspase3蛋白的表达显著增高。结论：绝经后循环高FSH水平可通过腺苷酸环化酶通路上调子宫内膜AQP2,抑制子宫内膜增殖、促进子宫内膜细胞凋亡,协同低E调节子宫内膜生理性萎缩。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1. 引言
• 2. 第一部分 FSH促排卵对人子宫内膜AQPs和容受因子的影响
• 2.1 资料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• 参考文献
• 3. 第二部分 FSH影响育龄期子宫内膜容受性的调控机制
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 结论
• 参考文献
• 4. 第三部分 长期高FSH刺激引起围绝经期子宫内膜萎缩的机制研究
• 4.1 材料和方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 4.4 结论
• 参考文献
• 综述一
• 参考文献
• 综述二
• 参考文献
• 作者简历及在读期间所取得的科研成果