大鼠肝脏缺血再灌注不同时限缺氧诱导因子1的表达变化及意义探讨

论文摘要

随着现代临床外科的进步,肝脏缺血再灌注损伤（hepatic ischemia andreperfusion injury,HIRI）在肝脏外科及肝脏移植中的作用越来越受到重视,对其损伤机制的研究也较多。肝脏血流减少及随后的再灌注期的微循环紊乱等均导致细胞内的缺氧环境,必然会引起维持机体氧平衡的重要调节蛋白缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）的表达变化。目前对肝脏缺血再灌注期HIF-1的时程表达特点及意义尚不清楚,少有文献报道。故本实验旨在研究肝脏缺血再灌注期HIF-1的时空表达特点及作用意义,以及其表达与HIRI过程中细胞损伤及细胞凋亡的关系,为肝脏缺血再灌注损伤的防治探索新的方向。实验一HIF-1α在大鼠肝脏不同缺血时限的表达变化及意义一目的建立大鼠肝脏缺血损伤模型,检测HIF-1α和Caspase-3蛋白在肝脏不同缺血时限的表达变化并探讨其意义。二方法1.健康SD大鼠35只随机分为正常组（5只）、假手术组（15只）、缺血组（15只）,假手术组及缺血组又按不同缺血时限分为30min、45min、60min三个亚组,每组5只大鼠,制备大鼠全肝血流阻断模型。2.血液标本由肝上下腔静脉抽取约2ml,检测血清ALT值。3.大鼠肝脏标本取材后经10%福尔马林固定,电镜标本取材后即放入预先配置的3%戊二醛中固定20min后进行修块取材。4.HE染色及免疫组织化学均按试剂盒内操作步骤进行,兔抗大鼠HIF-1α和Caspase-3的工作浓度为1:100,均购于武汉博士德生物工程有限公司。5.光镜及电镜下进行病理组织学观察,免疫组织化学SABC法检测HIF-1α和Caspase-3在肝脏不同缺血时限的表达量,采用HPIAS-1000高清晰彩色病理图像分析系统进行定量检测。6.所有计量数据应用SPSS 11.5进行统计学处理,采取析因设计方差分析分析主效应与交互效应后,LSD法检验各组间差别,P＜0.05表示有统计学意义。三结果1.正常组与假手术组的HIF-1α表达比较,其差别均不具有统计学意义（P＞0.05）。各时限缺血组与假手术组相比,其结果具有显著的统计学差异（P＜0.01）。自缺血30min后HIF-1α蛋白的表达即显著增加,且随缺血时限的延长呈逐渐上升趋势。在区域分布上可见,缺血30min时HIF-1α蛋白主要表达在汇管区门静脉、微血管、微胆管周围的细胞内,部分细胞内呈强阳性表达。缺血45min时,表达区域逐渐向小叶间中央静脉区蔓延,缺血60min时,中央静脉内皮细胞及其周围肝细胞中都可见到HIF-1α蛋白阳性表达。2.正常组与假手术组中Caspase-3蛋白阳性表达量较少,相比较无统计学差异（P＞0.05）。各时限点的缺血组与假手术组相比,均具有显著的统计学差异（P＜0.01）。随着缺血时限的延长,各缺血组Caspase-3的表达量在统计学上无差异（P＞0.05）。阳性细胞主要出现在肝窦状内皮细胞中。3.缺血组血清ALT水平均高于正常组及假手术组,随着缺血时限的增加,ALT逐渐上升,组织病理学损伤亦呈加重趋势。四讨论本实验研究结果表明,单纯的手术损伤未影响到肝脏的血供时,不会引起肝脏组织及细胞的损伤,故血清ALT值处于正常水平,作为机体缺氧调控因子的HIF-1α蛋白的表达量极低,凋亡执行蛋白Caspase-3的表达量也处于基线水平。一旦肝脏遭受缺血性损伤,即有HIF-1α蛋白应激性的显著表达上调,HIF-1α蛋白的积聚量与肝功能变化及细胞形态学损伤的程度呈一定的相关性,因此急性缺血期HIF-1α的表达强度可以作为反映机体缺氧损伤程度的一个敏感指标。大鼠遭受突发30min的肝缺血,即可使Caspase-3显著性表达上调,活化凋亡程序。因此,如何阻止肝窦内皮细胞中Caspase-3蛋白的表达上调与激活,可以作为减轻肝脏缺血损伤的防治方向之一。实验二HIF-1α在大鼠肝脏缺血45min再灌注不同时限表达变化及意义探讨一目的建立大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型,用免疫组织化学SABC法检测HIF-1α和Caspase-3蛋白在肝脏缺血45min再灌注不同时限的表达变化并探讨其意义,并观察丹参预处理对它们表达的影响。二方法1.健康SD大鼠80只随机分为正常组（5只）、假手术组（25只）、缺血再灌注组（25只）,丹参处理组（25只）,假手术组、缺血再灌注组及丹参处理组又按不同再灌注时限（0h、3h、12h、24h、72h）分为五个亚组,每组5只大鼠。2.模型制备、取材方法、HE染色及免疫组织化学染色步骤、观察方法及统计学处理等,同实验一。三结果1.HIF-1α在正常组与假手术组中阳性表达极弱,两者比较无统计学差异（P＞0.05）,在缺血后HIF-1α表达即明显增加,至再灌注12h后达到峰值,与同期假手术组比较均有显著性差异（P＜0.01）,再灌注24h后回落至基线水平。丹参处理组在再灌注0h、3h可上调HIF-1α表达,在再灌注12h时下调HIF-1α的表达,与同期缺血再灌注组比较均有统计学差异（P＜0.05）至再灌注24h亦回落至基线水平。3.Caspase-3在正常组与假手术组间表达亦无差别,两者比较（P＞0.05）,缺血后Caspase-3的表达迅速增加,至再灌注24h时达到峰值,与同期假手术组比较均具有显著性差异（P＜0.01）,再灌注72小时后回落至基线水平。丹参处理组与同期缺血再灌注组相比,均较低,两者具有统计学差异（P＜0.05）。3.病理形态学观察可见,肝脏经过缺血损伤后,随着再灌注时限的延长,组织及细胞损伤逐渐加剧,至再灌注24h时达到损害的顶峰,至再灌注72h损伤逐渐恢复至正常,丹参处理组较同时限点再灌注组损伤轻。四结论肝脏缺血损伤和再灌注损伤是一个密切联系、极其复杂的病理生理过程,有多种因素共同参与,HIF-1α和Caspase-3也参与此过程中。本实验通过对大鼠肝脏缺血45min再灌注0～72h内HIF-1α、Caspase-3及同期病理形态学损伤的观察,分析归纳该过程可能经历以下四期:①缺氧应激期（0～3h）,此期HIF-1α和Caspase-3表达迅速增强,镜下可见细胞及细胞器出现肿胀,肝窦间隙变窄,体现此期肝脏组织对缺氧损伤及氧化损伤迅速发生应激反应。②过度反应期（3～12h）,此期HIF-1α的表达继续增强,在12h时达峰值,并波及到肝脏的各个区域,Caspase-3亦继续增强表达,镜下可见部分区域细胞的肿胀更加明显,部分区域细胞胞核可见皱缩。③继续损伤期（12～24h）,此期HIF-1α蛋白表达逐渐减弱,至24h时已接近于基线水平,而Caspase-3继续增强表达,24h时达峰值,镜下可见此期组织细胞损伤逐渐加重,于24h左右组织损伤最重。④恢复期（24h～72h）,此期Caspase-3蛋白也逐步回落至基线水平,肝脏组织处于损伤的恢复阶段,形态学上亦可见肝组织的增殖及重构。本实验结果显示丹参在肝脏缺血再灌注中,能上调缺氧应激期HIF-1α的表达,抑制随后过度反应期的HIF-1α蛋白的表达量,推测丹参可能通过对HIF-1α表达的平衡调节作用,来发挥其抗缺氧、抗损伤的作用。丹参也能通过抑制凋亡因子的激活及表达,提高肝脏对损伤应激状态的适应,增加细胞存活机会,从而保护肝脏,具体机制及环节另需进一步的研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 背景与前言
• 第一部分 HIF-1α在大鼠肝脏不同缺血时限的表达变化及意义
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 参考文献
• 1.5 附图
• 第二部分 大鼠肝脏缺血45min再灌注不同时限HIF-1α的表达变化及意义探讨
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 参考文献
• 2.5 附图
• 综述 缺氧诱导因子1与氧化应激反应
• 攻读学位期间成果
• 致谢
• 统计审核学审稿合格证明