量子点标记的新型核酸探针的制备及其在原位杂交中的应用

论文摘要

量子点(Quantum Dots, QDs)是一种新型荧光纳米材料,具有很多优异的光学性质,不但具有宽激发窄发射的荧光特性、斯托克斯位移大、抗光漂白能力强、荧光寿命长等特点,而且其表面可以进行多种修饰从而满足不同应用的需要。量子点在过去二十年中,得到了非常广泛的关注,但是仍然有很多问题需要解决。特别是量子点广泛在生物领域应用的今天,如何提高其稳定性和生物相容性就显得非常重要了。基因探针(Gene probe)是一段碱基序列已知,且带有检测标记物,与待检测基因互补的核酸序列,它可以是整个基因,也可以是基因的一部分；可以是DNA本身,也可以是由之转录而来的RNA。基因探针通过分子杂交与目的基因结合,通过跟踪检测标记物,把目的基因显示出来。原位杂交(In situ hybridization histochemistry, ISHH)是原位杂交组织化学的简称,它是应用携带有标记物的特异碱基序列的核酸探针,按照碱基互补配对的原则,与组织细胞中待测的靶核酸特异性结合,进而形成杂交体,然后再应用相应的检测系统进行检测,将待测靶核酸在组织细胞中原有位置上显示出来。原位杂交的关键是核酸探针的标记,随着分子生物学研究的不断深入,现有的标记技术已不能满足需求,所以寻找更合适的标记技术以弥补现存标记技术的不足成为原位杂交研究的关键。鉴于量子点优异光学性质和其表面的可修饰性以及原位杂交中现有标记技术的不足,本课题对不同量子点进行稳定性研究,筛选出热稳定性较好,能够在EDC/NHS溶液中稳定存在量子点,并用这种量子点对DNA寡聚链进行了荧光标记,通过PCR扩增制备了量子点标记的新型核酸探针,最后用这种新型核酸探针在妊娠50天的大白母猪肌肉组织切片中进行了原位杂交实验。主要研究内容如下：1.可用于基因探针标记的量子点的初步筛选。通过对量子点的表面修饰和稳定性研究,对采用不同方法进行表面修饰的量子点的稳定性进行了初步筛选,筛选出了热稳定性较好,能够在EDC/NHS溶液中稳定存在量子点,确保其在与探针偶联后以及经过PCR扩增后仍然具有较好的荧光特性。2.制备CdSe/ZnS量子点标记的DNA荧光探针。用荧光光谱仪和琼脂糖凝胶电泳对结果进行了表明,结果表明单链DNA成功的标记上了量子点。相比以前的DNA荧光探针制备方法,这种方法相对简单、有效, 对DNA的测序、示踪、定位等工作具有重要意义。3.通过原位杂交实验验证了制备的CdSe/ZnS量子点标记的DNA荧光探针的生物活性及示踪和定位功能。所制备的CdSe/ZnS量子点标记的DNA荧光探针稳定性较好,经PCR扩增后仍然具有较强的荧光,成功的在大白母猪肌肉组织切片中对GAPDH基因进行了跟踪定位。实验结果表明制备CdSe/ZnS量子点量子点标记的新型核酸探针具有较好的生物活性及示踪和定位功能。本课题的研究结果显示了量子点标记的基因探针在原位杂交中的优势,不仅可作为基于量子点标记的核酸探针原位杂交实验的参考,为量子点这一新型荧光材料在生物领域的应用提供了依据,同时也显示了量子点作为荧光标记材料在基因测序、示踪、定位等生物领域具有非常广阔的应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 前言
• 1 量子点概述
• 1.1 量子点的定义
• 1.2 量子点的发展历程
• 1.3 量子点的光学特性
• 1.3.1 量子点的发光机理
• 1.3.2 量子点的光学性质
• 1.4 量子点的生物应用
• 1.4.1 量子点在免疫荧光分析中的应用
• 1.4.2 量子点在细胞标记中的应用
• 1.4.3 量子点在活体成像中的应用
• 1.4.4 量子点在探针标记中的应用
• 2 基因探针概述
• 2.1 基因探针的定义
• 2.2 探针的标记技术
• 2.2.1 传统探针标记技术
• 2.2.2 量子点标记技术
• 3 原位杂交概述
• 3.1 原位杂交的定义
• 3.2 原位杂交的应用
• 4 课题设计
• 4.1 课题的设计思想
• 4.2 课题的研究内容
• 第二章 PAMAM树状大分子修饰CdSe量子点的制备及其稳定性研究
• 1 引言
• 2 试剂与仪器
• 2.1 试剂
• 2.2 仪器
• 3 实验方法
• 3.1 PAMAM树状大分子的合成
• 3.1.1 原料除水
• 3.1.2 不同代数的PAMAM树状大分子合成
• 3.2 PAMAM树状大分子为内模板合成CdSe量子点
• 2+/PAMAM树状大分子配合物的制备'>3.2.1 Cd²⁺/PAMAM树状大分子配合物的制备
• 3.2.2 硒源前驱体NaHSe溶液的制备
• 3.2.3 PAMAM树状大分子修饰的CdSe量子点的合成
• 3.2.4 4.5代PAMAM树枝状大分子为内模板合成CdSe量子点的优化
• 3.3 PAMAM树状大分子修饰的CdSe量子点的稳定性研究
• 3.3.1 温度对4.5代PAMAM树状大分子修饰的CdSe量子点稳定性的影响
• 3.3.2 偶联剂对4.5代PAMAM树状大分子修饰的CdSe量子点稳定性的影响
• 4 结果与讨论
• 4.1 PAMAM树状分大子红外表征
• 4.2 4.5 代PAMAM树状大分子修饰的CdSe量子点的光学性质表征
• 4.3 温度对4.5代PAMAM树状大分子修饰的CdSe量子点荧光强度的影响
• 4.4 偶联试剂对4.5代PAMAM树状大分子修饰的CdSe量子点荧光强度的影响
• 5 本章小结
• 第三章 疏水性CdSe/ZnS量子点的亲水化修饰及其稳定性研究
• 1 引言
• 2 试剂与仪器
• 2.1 试剂
• 2.2 仪器
• 3 实验方法
• 3.1 MPA亲水化修饰疏水性CdSe/ZnS量子点及其稳定性研究
• 3.1.1 MPA亲水化修饰疏水性CdSe/ZnS量子点
• 3.1.2 MPA亲水化修饰疏水性CdSe/ZnS量子点稳定性研究
• 3.2 OPA亲水化修饰的CdSe/ZnS量子点的稳定性研究
• 3.2.1 OPA亲水化修饰疏水性CdSe/ZnS量子点的稳定性研究
• 4 结果与讨论
• 4.1 MPA亲水化修饰CdSe/ZnS量子点的光学性质表征
• 4.2 温度对MPA亲水化修饰CdSe/ZnS量子点荧光强度的影响
• 4.3 偶联试剂EDC/NHS对MPA亲水化修饰CdSe/ZnS量子点荧光强度的影响
• 4.4 温度对OPA亲水化修饰CdSe/ZnS量子点荧光强度的影响
• 4.5 偶联试剂OPA亲水化修饰的CdSe/ZnS量子点荧光强度的影响
• 5 本章小结
• 第四章 CdSe/ZnS量子点偶联DNA荧光探针的制备与表征
• 1 引言
• 2 试剂与仪器
• 2.1 试剂
• 2.2 仪器
• 3 实验方法
• 3.1 OPA亲水化修饰的CdSe/ZnS量子点偶联DNA荧光探针的制备与表征
• 3.1.1 OPA亲水化修饰的CdSe/ZnS量子点偶联DNA荧光探针的制备
• 3.1.2 OPA亲水化修饰的CdSe/ZnS量子点偶联DNA荧光探针的电泳实验
• 4 结果与讨论
• 4.1 偶联CdSe/ZnS量子点的DNA荧光探针的荧光光谱表征
• 4.2 偶联CdSe/ZnS量子点的DNA荧光探针琼脂糖凝胶电泳表征
• 5 本章小结
• 第五章 CdSe/ZnS量子点标记的新型核酸探针在原位杂交中的应用
• 1 引言
• 2 试剂、材料与仪器
• 2.1 试剂、材料
• 2.2 仪器
• 3 实验方法
• 3.1 GAPDH基因引物的模板cDNA的制备
• 3.1.1 C2C12细胞的总RNA的提取
• 3.1.2 将RNA反转录为cDNA
• 3.2 量子点标记的GAPDH前引物荧光探针制备
• 3.3 PCR扩增制备量子点标记的GAPDH基因探针
• 3.4 量子点标记的GAPDH基因探针在原位杂交中的应用
• 3.4.1 组织采集、包埋与切片
• 3.4.2 组织染色
• 3.4.3 原位杂交实验
• 4 结果与讨论
• 4.1 C2C12细胞的总RNA的电泳表征
• 4.2 GAPDH引物PCR扩增结果表征
• 4.3 量子点标记的GAPDH前引物荧光探针及其PCR扩增产物电泳表征
• 4.5 大白母猪背肌切片的组织染色结果
• 4.6 原位杂交实验结果
• 5 本章小结
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录