Penicillium sp.1523液态发酵生产柚苷酶及酶的固定化研究

论文摘要

柚苷酶（Naringinase）是由a-L-鼠李糖苷酶（a-L-rhamnosidase, EC 3.2.1.40）和β-D-葡萄糖苷酶（flavonoid-β-D-glucosidase, EC 3.2.1.21）组成的酶复合体,可以将柑橘汁中的主要苦味物质柚苷分两步水解成鼠李糖、柚配质（Naringenin）和葡萄糖从而达到脱苦的目的；与其它脱苦方法相比,该法脱苦具有反应条件比较温和、可以较好的保持柑橘汁的品质、工艺简单、环保无污染等优势因而是最理想的脱苦方法；除此之外柚苷酶还可以用于酶解修饰天然植物黄酮糖链以改善天然植物黄酮生物学活性、增强天然植物雌性激素活性及葡萄酒的增香等领域。目前柚苷酶的生产水平较低,几乎未见工业化生产的报道,这限制了其在工业生产中的应用,因此开展相关研究以提高柚苷酶生产水平具有积极的现实意义。本文以实验室选育的Penicillium sp.1523为出发菌株,对其摇瓶发酵条件的优化、分批发酵动力学、柚苷酶的分离纯化及固定化进行了系统研究,主要结果如下：将单因素试验、Plackett-Burman设计法和响应面分析法相结合,对Penicilliumsp.1523产柚苷酶的摇瓶发酵条件进行了优化。单因素试验结果显示发酵培养基中的最优碳源为玉米粉、最优氮源为豆饼粉、种龄和接种量分别为36 h和5%。通过Plackett-Burman设计筛选出影响柚苷酶产量的三个重要因素为玉米粉、豆饼粉和柚苷,在此基础上运用最陡爬坡试验逼近最大响应区域,再利用Box-Behnken试验设计及响应面分析法进行回归分析,获得的最佳培养基配方为：玉米粉31.14g/L、豆饼粉31.53 g/L、柚苷1.65 g/L、K2HPO4 1.00 g/L, ZnSO4 0.10 g/L, MgSO4·7H2O 0.06 g/L CaCl2 0.10 g/L。在优化后的发酵条件下发酵液中柚苷酶酶活为891.79±6.33 U/mL,与模型预测值非常接近,为后面的发酵放大提供了依据。利用5L发酵罐对Penicillium sp.1523产柚苷酶的发酵过程进行了放大,在优化条件下发酵液柚苷酶酶活可达到1229.40 U/mL,比摇瓶发酵提高了41.0%；同时以该菌株在5L发酵罐中分批发酵的数据为依据,并结合数学推导建立了其分批发酵生产柚苷酶的菌体生长、柚苷酶合成以及基质消耗动力学模型,分别如下：（1）菌体生长动力学模型（2）柚苷酶合成动力学模型（3）基质消耗动力学模型所建模型基本能够描述Penicillium sp.1523分批发酵产柚苷酶的动态过程,可以为以后的进一步放大试验提供参考。对柚苷酶的分离纯化工艺进行了研究,依次采用超滤、硫酸铵盐析和SephadexG-200凝胶过滤层析操作对柚苷酶进行逐级纯化,通过SDS-PAGE电泳对各步骤的纯化结果进行分析鉴定。结果显示纯化后的柚苷酶比活力达到4478.85 U/mmg,纯化倍数为11.99倍,活力回收率为38.10%。纯化后的柚苷酶经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定显示两条清晰的条带,说明该酶由两个亚基组成,其分子量分别为89 kDa和72 kDa。采用国产TJS树脂对柚苷酶进行固定化研究。将单因素试验和Box-Behnken试验设计结合对影响TJS树脂固定化柚苷酶的主要因素进行优化。结果显示最佳固定化条件为：酶液pH 6.5、固定化温度为26.6℃、载体投放量为0.79g、固定化时间为24 h,此时固定化柚苷酶酶活达到3949.32 U/g,酶活回收率提高至44.79%,蛋白固定率为98.43%,说明将TJS树脂用于柚苷酶的固定化是切实可行的。以上研究为柚苷酶的工业化生产和实际应用奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 1 绪言
• 1.1 柑橘汁中主要苦味物质柚苷的去除方法
• 1.1.1 屏蔽法
• 1.1.2 吸附法
• 1.1.3 膜分离法
• 1.1.4 柚苷酶法
• 1.1.5 其它方法
• 1.1.6 小结
• 1.2 柚苷酶的研究进展
• 1.2.1 柚苷酶及其作用机理
• 1.2.2 柚苷酶发酵研究进展
• 1.2.3 柚苷酶的固定化
• 1.3 研究的目的意义及内容
• 1.3.1 研究的目的意义
• 1.3.2 研究内容
• 2 Penicillium sp.1523产柚苷酶的摇瓶发酵条件优化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 主要仪器
• 2.2.4 培养基
• 2.2.5 分析方法
• 2.2.6 单因子试验
• 2.2.7 Plackett-Burman试验设计
• 2.2.8 最陡爬坡试验设计
• 2.2.9 响应面试验设计
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 碳源的确定
• 2.3.2 氮源的确定
• 2.3.3 种龄和接种量的确定
• 2.3.4 Plackett-Burman设计法筛选最重要影响因素
• 2.3.5 最陡爬坡试验
• 2.3.6 响应面分析法优化培养基
• 2.4 小结
• 3 Penicillium sp.1523分批发酵动力学研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 主要仪器
• 3.2.4 培养基
• 3.2.5 培养方法和发酵条件
• 3.2.6 分析方法
• 3.2.7 试验数据的获得
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 Penicillium sp.1523分批发酵过程曲线
• 3.3.2 Penicillium sp.1523分批发酵动力学模型的建立
• 3.4 小结
• 4 柚苷酶的分离纯化
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要试剂
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 试验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 超滤纯化效果
• 4.3.2 盐析纯化效果
• 4.3.3 Sephadex G-200纯化效果
• 4.3.4 SDS-PAGE鉴定
• 4.3.5 柚苷酶纯化总结
• 4.4 小结
• 5 柚苷酶的固定化
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 主要仪器
• 5.2.2 分析方法
• 5.2.3 单因素试验设计
• 5.2.4 Box-Benhnken试验设计
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 单因素试验
• 5.3.2 Box-Benhnken试验
• 5.4 小结
• 6 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录