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动态高压微射流技术对酶的活性与构象变化的影响

2020-12-07阅读(285)

动态高压微射流技术对酶的活性与构象变化的影响

论文摘要

动态高压微射流（DHPM）是一种新兴的非热技术,集高速撞击、高频振荡、瞬时压降、高速剪切和气穴作用于一体,压力可高达200MPa,这种新技术不仅基于高压能力,并且基于不同几何学设计的反应腔（chamber）而获得10—15倍传统阀式均质机,连续操作费时短也不同于静高压。本课题旨在研究DHPM对多酚氧化酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的活性与构象变化的影响,尤其关注的是在去折叠态下酶学性质、动力学、稳定性和构象变化的分子机理。本文研究了中国早酥梨多酚氧化酶的酶学性质和动力学,以邻苯二酚为底物,测得其Vmax为289.2units/min和Km为3.8mmol/L,表明早酥梨多酚氧化酶对邻苯二酚具有较高的亲和性;催化反应速率与其浓度成正比;最适pH和温度分别为4.5和45℃。研究了DHPM对早酥梨多酚氧化酶活性影响,表明随着处理压力增加,相对活性从未处理的100%升高至180MPa的182.5%;同等压力下,相对活性随着处理次数的增加而增加;酶液温度（25、35和45℃）在120和140MPa处理条件下影响较大。DHPM对香菇多酚氧化酶处理也是活性升高。处理压力和次数对香菇多酚氧化酶有显著影响,在110MPa处理一次,其相对活性最高达110.7%;在150MPa处理1-3次,其相对活性分别增加10.4%、10.9%和11.57%,处理3次后相对活性为111.5%。研究了香茹多酚氧化酶的活性与分子构象的机理,圆二色谱显示其二级结构如α-helix遭到破坏,揭示相对活性的提高与其α-helix含量下降有关,荧光光谱显示香茹多酚氧化酶的Trp和Tyr残基或多或少暴露于溶剂中,这一结果与紫外光谱分析相符,巯基测定表明香菇多酚氧化酶表面的巯基基团含量增加。我们发现经DHPM处理后,香茹多酚氧化酶二级结构发生改变,分子构象处于去折叠态。DHPM对胰蛋白酶的活性没有显著影响,80、100、120和160MPa处理后,胰蛋白酶相对活性分别保留98.5%、98.3%、97.8%和97%。但DHPM处理显著提高了胰蛋白酶的热稳定性和pH稳定性,表现在:45℃保温100min后,未经处理的胰蛋白酶残留活性为86%,而经DHPM 80MPa处理的胰蛋白酶残留活性为96%;DHPM对胰蛋白酶最适pH值没影响,而经DHPM 80、100和120MPa处理后,胰蛋白酶在最适pH（pH=7.6）的活性有所提高,相对活性分别为97%,102%及103%。对胰蛋白酶构象变化分析表明,动态高压微射流处理后胰蛋白酶荧光强度增强、游离巯基含量增加,总巯基含量减少、紫外吸收强度减弱、α-helix强度减弱。这说明DHPM处理导致胰蛋白酶的分子构象部分去折叠态。这一成果进一步印证我们关于天然热力学最稳态不一定是其活性最高态的理论假设。胰蛋白酶经DHPM处理后构象部分去折叠态导致其反应稳定性增强。根据热动力学假设,去折叠态的胰蛋白酶并不是处在能量最低状态,而是处于一种热力学不稳定的过渡态,随时可能进行refolding或聚集而丧失其反应稳定性。我们提出新的设想:在酶（或蛋白质）的过渡性构象中,通过Patchthe surface（补丁法）、Dowel the exposed amino acid（桩法）、Wedge in gapbetween amino acids（楔法）三种方式来固定其不稳态的去折叠态构象从而维持其更高活性的策略和理论设想。本实验采用mPEG-SC修饰即补丁法策略,结果表明:与天然胰蛋白酶（NT）相比,经DHPM处理后unfolding胰蛋白酶（DT）经mPEG-SC修饰后（NTP、DTp）,其储存稳定性和热稳定性显著增强。在4℃贮存8后,NT和NTp变化不大,分别保持61%和59.9%;80和100MPa不同压力处理下经mPEG-SC修饰的D80TP和D100TP相对活性分别保持在78%和74%,而未修饰的D80T和D100T相对活性分别陡降到56.5%和50%;热稳定性方面,55℃处理10min后,D80TP和D100TP相对活性均保持在87%左右,而D80T和D100T仅存70%的相对活性。目前学术界对热稳定性机理没有统一的解释,认为导致酶或蛋白质热稳定性的原因主要有以下几个方面:表面疏水性/亲水性的变化、表面电荷分布的变化、热变性速率和自水解速率的降低、氢键的形成及解链温度的降低。本实验表明mPEG-SC修饰后,去折叠的胰蛋白酶分子内残基之间的相互作用以及残基和介质之间的相互作用发生了变化,导致去折叠胰蛋白酶的分子构象发生变化,可能是其热稳定性增强的原因。比较分析DHPM不同chamber（美国Microfluidics公司M-chamber和中国廊坊通用机械公司的反应腔L-chamber）对木瓜蛋白酶性质和构象变化影响的结果表明,两种chamber都导致木瓜蛋白酶活性降低,巯基含量升高。160MPa下处理三次后,M-chamber处理的木瓜蛋白酶（MP）相对活性降低至76.02%,巯基含量增加至110.89%,而L-chamber处理的木瓜蛋白酶（LP）相对活性保留在86.28%,巯基含量为105.36%;MP紫外吸收峰发生蓝移,酪氨酸和色氨酸的荧光最大发射峰红移而LP紫外吸收和荧光光谱几乎没有变化。实验表明在相同的处理压力和处理条件下,不同的chamber仍会导致木瓜蛋白酶产生不同的性质和构象变化,从而证实了我们所提出的“伪压”现象。通过PyMOLWin软件构造出天然木瓜蛋白酶三维结构模式。在此基础上并根据实验中测得的去折叠态木瓜蛋白酶的构象变化,预测了M-chambers处理后去折叠态木瓜蛋白酶的三维结构图。与天然木瓜蛋白酶相比,去折叠态木瓜蛋白酶结构更加松散、二硫键断裂、酪氨酸和色氨酸残基暴露、α-helix含量降低。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略语与符号
  • 第1章 绪论
  • 1.1 动态高压微射流技术的国内外研究现状
  • 1.1.1 动态高压微射流的技术基础
  • 1.1.2 动态高压微射流技术的装备、原理和概念
  • 1.1.3 动态高压微射流技术的应用
  • 1.2 酶（蛋白质）学研究的国内外研究现状
  • 1.2.1 酶的蛋白质化学本质
  • 1.2.2 蛋白质（酶）的构象分析（X-衍射、核磁共振、园二光谱、傅立叶红外、荧光、紫外等）
  • 1.2.3 酶的改性技术
  • 1.3 多酚氧化酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的国内外研究现状
  • 1.3.1 多酚氧化酶的国内外研究现状
  • 1.3.2 胰蛋白酶的国内外研究现状
  • 1.3.3 木瓜蛋白酶的国内外研究现状
  • 1.4 选题意义、课题来源和研究内容
  • 1.4.1 选题意义和课题来源
  • 1.4.2 研究内容
  • 第2章 动态高压微射流对中国早酥梨中多酚氧化酶的酶学特性的影响
  • 2.1 引言
  • 2.2 材料和方法
  • 2.2.1 材料和试剂
  • 2.2.2 早酥梨中多酚氧化酶PPO的提取
  • 2.2.3 多酚氧化酶PPO活性测定
  • 2.2.4 以邻苯二酚为底物的PPO动力学
  • 2.2.5 多酚氧化酶PPO酶液浓度的影响
  • 2.2.6 pH值的影响
  • 2.2.7 反应温度的影响
  • 2.2.8 动态高压微射流各参数对多酚氧化酶的处理
  • 2.2.9 统计学分析
  • 2.3 结果和分析
  • 2.3.1 以邻苯二酚为底物的PPO酶动力学
  • 2.3.2 不同浓度对PPO反应速率的影响
  • 2.3.3 不同pH值对PPO活性影响
  • 2.3.4 不同温度对PPO活性的影响
  • 2.3.5 DHPM对PPO活性的影响
  • 第3章 动态高压微射流对香菇多酚氧化酶的激活作用及构象改变的分子机理
  • 3.1 引言
  • 3.2 材料和方法
  • 3.2.1 实验材料
  • 3.2.2 DHPM对香茹PPO处理
  • 3.2.3 香菇PPO活性的测定
  • 3.2.4 香菇PPO圆二色谱分析
  • 3.2.5 香菇PPO荧光发射光谱分析
  • 3.2.6 香菇PPO紫外吸收光谱分析
  • 3.2.7 香菇PPO巯基含量测定
  • 3.2.8 统计学分析
  • 3.3 结果与讨论
  • 3.3.1 DHPM对香菇PPO的激活作用
  • 3.3.2 DHPM对香菇PPO构象影响的圆二色谱分析
  • 3.3.3 DHPM对香菇PPO构象影响的荧光发射光谱分析
  • 3.3.4 DHPM对香菇PPO构象影响的紫外吸收光谱分析
  • 3.3.5 DHPM对香菇PPO的巯基含量影响
  • 3.4 结论
  • 第4章 动态高压微射流处理对胰蛋白酶活性、稳定性和构象变化的影响
  • 4.1 引言
  • 4.2 材料和方法
  • 4.2.1 试剂
  • 4.2.2 胰蛋白酶的DHPM处理
  • 4.2.3 胰蛋白酶活性测定
  • 4.2.4 最适反应温度和温度稳定性的测定
  • 4.2.5 最适pH和pH稳定性测定
  • 4.2.6 SDS-PAGE测定胰蛋白酶的分子量
  • 4.2.7 巯基含量的测定
  • 4.2.8 紫外光谱扫描
  • 4.2.9 红外光谱扫描
  • 4.2.10 荧光光谱分析
  • 4.2.11 数据分析
  • 4.3 结果和讨论
  • 4.3.1 DHPM对胰蛋白酶相对活性的影响
  • 4.3.2 DHPM对胰蛋白酶最适反应温度和温度稳定性的影响
  • 4.3.3 DHPM对胰蛋白酶最适pH和pH稳定性的影响
  • 4.3.4 DHPM对胰蛋白酶分子量的影响
  • 4.3.5 DHPM对胰蛋白酶游离巯基和总巯基含量的影响
  • 4.3.6 DHPM对胰蛋白酶构象影响的紫外吸收光谱分析
  • 4.3.7 DHPM对胰蛋白酶构象影响的FT-IR分析
  • 4.3.8 DHPM对胰蛋白酶构象影响的荧光光谱分析
  • 4.4 结论
  • 第5章 聚乙二醇修饰对unfold胰蛋白酶的稳定性影响
  • 5.1 引言
  • 5.2 材料和方法
  • 5.2.1 试剂
  • 5.2.2 unfold胰蛋白酶的DHPM处理
  • 5.2.3 mPEG-SC修饰胰蛋白酶
  • 5.2.4 胰蛋白酶活性测定
  • 5.2.5 储存稳定性测定
  • 5.2.6 修饰度的测定
  • 5.2.7 热稳定性测定
  • 5.2.8 数据分析
  • 5.3 结果和讨论
  • 5.3.1 mPEG-SC修饰对天然和unfold胰蛋白酶活性的影响
  • 5.3.2 mPEG-SC修饰对天然和unfold胰蛋白酶储存稳定性的影响
  • 5.3.3 天然和unfold胰蛋白酶修饰度的测定
  • 5.3.4 mPEG-SC修饰对天然和unfold胰蛋白酶热稳定性的影响
  • 5.4 结论
  • 第6章 动态高压微射流对木瓜蛋白酶活性和构象的影响
  • 6.1 引言
  • 6.2 材料与方法
  • 6.2.1 材料与试剂
  • 6.2.2 木瓜蛋白酶的DHPM处理
  • 6.2.3 木瓜蛋白酶的活性测定
  • 6.2.4 木瓜蛋白酶中巯基总量的测定
  • 6.2.5 木瓜蛋白酶的紫外吸收光谱分析
  • 6.2.6 木瓜蛋白酶的同步荧光光谱分析
  • 6.2.7 木瓜蛋白酶分子结构的预测与模拟
  • 6.3 结果与讨论
  • 6.3.1 DHPM对木瓜蛋白酶活性的影响
  • 6.3.2 DHPM对木瓜蛋白酶巯基总量的影响
  • 6.3.3 DHPM处理后木瓜蛋白酶的紫外吸收光谱分析
  • 6.3.4 DHPM处理后木瓜蛋白酶的同步荧光光谱分析
  • 6.3.5 木瓜蛋白酶分子结构的预测和模拟
  • 6.4 结论
  • 第7章 不同反应腔的动态高压微射流处理对木瓜蛋白酶酶学性质的影响
  • 7.1 引言
  • 7.2 材料与方法
  • 7.2.1 材料与试剂
  • 7.2.2 高压动态微射流处理
  • 7.2.3 木瓜蛋白酶活性测定
  • 7.2.4 木瓜蛋白酶中巯基总量的测定
  • 7.2.5 木瓜蛋白酶的紫外吸收光谱分析
  • 7.2.6 木瓜蛋白酶的同步荧光光谱分析
  • 7.2.7 数据分析
  • 7.3 结果与分析
  • 7.3.1 不同反应腔DHPM对木瓜蛋白酶活性的影响
  • 7.3.2 不同反应腔DHPM对木瓜蛋白酶巯基（SH）总量的影响
  • 7.3.3 不同反应腔DHPM对木瓜蛋白酶的紫外吸收光谱的变化影响
  • 7.3.4 不同反应腔DHPM对木瓜蛋白酶的同步荧光光谱变化的影响
  • 7.4 结论
  • 第8章 结论与展望
  • 8.1 本文取得的成果与主要结论
  • 8.2 有待进一步的工作
  • 8.3 创新点
  • 8.4 展望
  • 参考文献
  • ACKNOWLEDGEMENTS
  • 攻读学位期间发表或录用相关的论文（第一作者）

    • 相关论文文献

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