二苯乙烯苷对阿霉素心脏毒性的体内外保护作用及机制

论文摘要

第一部分二苯乙烯苷对阿霉素心脏毒性的体内外保护作用及机制阿霉素（DOX）是一种高效广谱的葸环类抗肿瘤抗生素，心脏毒性是阿霉素临床应用的主要不良反应之一，因出现剂量依赖性的严重心力衰竭而使它的应用受到限制。DOX所致心脏毒性的机制至今仍未完全阐明，但有许多证据表明其与产生的大量自由基密切相关。2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷（2，3，5，4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG）是何首乌的活性单体，体外实验研究表明THSG具有较强的抗氧化活性。已有的研究也证实THSG能够降低阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease）模型小鼠和缺血再灌注损伤模型小鼠组织中的过氧化物水平。THSG的化学结构与白藜芦醇相似，后者具有显著的保护受损心肌的作用。所以我们推测THSG对DOX导致的心脏毒性具有保护作用。论文将分别以体外培养的乳鼠心肌细胞和DOX诱导的小鼠急性心脏毒性模型为对象探讨THSG的保护作用及机制。§1 THSG对小鼠急性阿霉素心脏毒性的保护作用及机制1．THSG对急性阿霉素心脏毒性的保护作用方法：一次性腹腔注射DOX 15mg／kg诱导急性心脏毒性模型，给予THSG 0．1g／kg灌胃一天1次，连续7天。观察THSG对小鼠阿霉素心脏毒性的保护作用。结果：①体重和生存率：处理前各组小鼠体重无明显差别。处理第7天，DOX组小鼠体重（21．8±3．6 g）和空白对照组（25．6±2．6 g，P＜0．01）比较明显减轻；给予THSG（0．1g／kg·d）治疗后没有增加造模小鼠的体重（22．5±2．8 g，P＞0．05 compared with DOXalone）。处理7天后，3组小鼠心脏指数（心脏重量与体重的比值）分别为空白对照组：4．5±0．6mg/g；DOX组：4．3±0．7mg/g；THSG组：4．3±0．4 mg/g，统计学分析均无明显差异。对照组20只动物全部存活，DOX处理7天后动物存活70％，给予THSG治疗后动物存活率升高为85％（P＞0．05，log rank test）。②组织学观察：正常对照组小鼠心肌纤维完整，排列整齐，无出血和水肿。DOX模型组可见明显的心肌纤维断裂甚至消失，心肌间质水肿并伴有局灶性心内膜下出血。而THSG治疗组和DOX模型组相比心肌纤维受损程度明显降低。2．THSG对急性阿霉素心脏毒性小鼠血清LDH和CK水平的影响方法：生物化学法测定血清LDH和CK的水平结果：DOX处理后第七天，血清中LDH水平从空白对照组3．87±0．40 U／ml上升到6．00±0．27 U／ml （P＜0．01）。经过THSG（0．1 g／kg·d）治疗后，LDH水平显著降低，为4．86±0．20U／ml（P＜0．05）。血清中CK水平从正常组1．55±0．49 U／ml上升到模型组3．02±0．28U／ml （P＜0．01）。经过THSG（0．1g／kg·d）治疗后CK水平降至1．94±0．4U／ml，与DOX单独处理组比较差异有显著性（P＜0．05）。3．THSG对急性阿霉素心脏毒性小鼠心肌组织中MDA和GSH含量的影响方法：生物化学方法测定心肌组织中MDA和GSH的含量结果：DOX处理后第七天，MDA含量从空白对照组1．15±0．30 nmol／mg protein上升到4．17±0．91 nmol／mg protein（P＜0．01）。THSG（0．1g／kg·d）可以显著抑制MDA的升高，其数值为2．32±0．76 nmol／mg protein（P＜0．01）。DOX处理后第七天，GSH含量从正常组24．43±6．57mg/g protein下降到模型组13．65±3．46 mg/g protein（P＜0．01）。THSG（0．1g／kg·d）可以升高GSH含量，为18．31±3．27 mg/g protein，与DOX组比较差异有显著性（P＜0．01）。§2 THSG对阿霉素损伤心肌细胞的保护作用及机制1．THSG对阿霉素引起的心肌细胞存活减少的影响方法：MTT法分析心肌细胞存活率。结果：空白对照组细胞存活率为100％，THSG300μM作用24h后细胞存活率为101．50±5．84％，与空白对照组比较差异无统计学意义。加入DOX 1μM作用24小时后，细胞存活率下降为72．68±8．52％（P＜0．01）。THSG 3，10，30，100，300μM可剂量依赖性削弱DOX导致的细胞存活率下降，其值分别为76．09±10．24％，81．37±9．84％，83A3±11．47％，91．21±7．54％，95．24±10．87％。除3μM THSG组与DOX单独处理组比较差异无统计学意义外，其余均有显著性（P＜0．05，P＜0．01）。2．THSG对阿霉素引起的细胞凋亡的影响方法：TUNEL法检测细胞凋亡。结果：空白对照组凋亡阳性细胞百分率为4．57±+0．52，给予DOX 1μM作用24小时后，细胞凋亡率明显增加为32．55±3．47％（P＜0．01）。THSG10，30，100，300μM可剂量依赖性减少DOX导致的细胞凋亡，其凋亡阳性细胞百分率分别为26．53±3．27％，20．12±2．64％，13．34±8．64％，10．48±1．57％，与DOX单独处理组比较，差异均有统计学意义（P＜0．05，P＜0．01）。3．THSG对阿霉素导致的心肌细胞线粒体膜电位降低的影响方法：采用荧光标记法检测线粒体膜电位。结果：正常对照组细胞伸展良好并呈现出红色或橙色荧光，定量分析显示其红绿荧光比例为14．52±3．86％。给予DOX 1μM作用24小时后，心肌细胞多数固缩为圆形并显示绿色荧光，红绿荧光比例为0．61±0．16％（P＜0．01，compared with control），提示细胞线粒体膜电位降低。THSG10，30，100，300μM可剂量依赖性减轻DOX导致的心肌细胞线粒体膜电位的降低，其荧光比例分别为1．48±0．34％，2．32±0．46％，3．70±0．87％，5．35±1．25％，除10μM THSG组与DOX单独处理组比较差异无统计学意义外，其余均有显著性（P＜0．01）。4．THSG对阿霉素引起的活性氧自由基增多的影响方法：采用荧光标记法检测氧自由基。结果：细胞内氧自由基经标记后呈现绿色荧光。定量分析数据用各组细胞绿色荧光面积和正常对照组细胞荧光面积的百分率来表示。正常对照组为100％，给予DOX 1μM作用24小时后荧光比值为337．56±45．56％（P＜0．01，compared with control），提示阿霉素导致心肌细胞氧自由基增多。THSG 30，100，300μM可剂量依赖性减轻DOX导致的氧自由基增多，其荧光比例分别为265，65±23，46％，227．70±2657％，184．17±34．52％，与DOX单独处理组比较，差异均有统计学意义（P＜0．05，P＜0．01）。5．THSG对阿霉素引起的凋亡相关蛋白表达改变的影响方法：用Western blot检测caspase-3，Bcl-2和Bax蛋白表达。结果：①DOX 1μM诱导24h后，caspase-3活化较正常对照组明显增加，且17kDa条带灰度明显深于正常对照组。caspase-3（17kDa）灰度值与内参β-actin灰度值的比值从正常对照组0．08±0．01上升到1．31±0．27，并有显著性差异（P＜0．01）。THSG30，100，300μM可以剂量依赖性抑制DOX导致的caspase-3蛋白的激活，其17kDa条带灰度值与内参β-actin灰度值的比值分别为0．80±0．14、0．42±0．06、0．12±0．13，与DOX单独处理组比较差异均有显著性（P＜0．05，P＜0．01）。②DOX 1μM诱导24h后，Bcl-2蛋白表达量较正常对照组明显增加，Bcl-2蛋白灰度值与内参β-actin灰度值的比值从正常对照组0．42±0．04上升到0．88±0．09，并有显著性差异（P＜0．05）。THSG30，100，300μM可以剂量依赖性地使DOX导致的Bcl-2蛋白表达量的增高更加显著，其灰度比值分别为0．99±0．10，1．37±0．08，1．64±0．12，除30μM THSG组与DOX单独处理组比较差异无统计学意义外，其余均有显著性（P＜0．05，P＜0．01）。③DOX 1μM诱导24h后，Bax蛋白表达量较正常对照组明显增加，Bax蛋白灰度值与内参β-actin灰度值的比值从正常对照组0．64±0．07上升到1．09±0．12，差异有显著性意义（P＜0．05）。THSG 30，100，300μM可以剂量依赖性抑制DOX引起的Bax蛋白表达量增加，其灰度比值分别为0．95±0．08，0．75±0．06，0．66±0．05，除30μM THSG组与DOX单独处理组比较差异没有统计学意义外，其余均有显著性（P＜0．05，P＜0．01）。6．THSG对阿霉素导致的心肌细胞胞内钙水平增高的影响方法：加载荧光探针后用激光共聚焦检测细胞胞内钙水平[Ca2+]i。结果：加入1μM DOX后，心肌细胞胞内钙水平快速增高并在5min后持续上升，5min时其荧光强度与基础值的比值为2．33±0．43。THSG 30μM预孵育2h可以显著抑制DOX导致的胞内钙水平增高，并使这种增高在2min内进入平台期，5min时其荧光强度与基础值的比值为1．33±0．07。THSG 100、300μM预孵育2h几乎能够使胞内钙水平在DOX加入后保持不变，5min时其荧光强度与基础值的比值分别为1．09±0．04、1．06±0．02。所有THSG组与DOX单独处理组比较均有统计学差异（P＜0．01）。结论：①THSG对DOX诱导的小鼠急性心脏毒性有保护作用，且作用与抑制DOX引起的氧化损伤有关。②THSG能够减少DOX诱导的细胞凋亡，而且作用与减少细胞线粒体膜电位下降，抑制caspase-3激活，增加Bcl-2及减少Bax的蛋白表达有关。③THSG抑制DOX引起的活性氧自由基增多。④THSG能够抑制DOX诱导的心肌细胞胞内钙浓度增高。第二部分体外培育牛黄镇痛作用的电生理机制研究牛黄是名贵中药，《本草纲目》记载：其“清心解毒、凉肝息风”，主治惊厥抽搐、癫痫发狂、咽喉肿痛等症。以牛黄为主要成分的牛黄千金散、牛黄解毒丸等经典中成药主要用于解热、镇痛，具有良好的临床疗效。已证实，牛黄及培植牛黄均能显著降低醋酸所致的小鼠疼痛反应。关于牛黄镇痛的作用机制，除与抗炎止痛有关外，推测也可能涉及对痛觉信息传入的直接干预作用。天然牛黄药源匮乏、价格昂贵。国家药品监督管理部门自1972年陆续批准了3个牛黄代用品：人工牛黄、培植牛黄、体外培育牛黄。体外培育牛黄（calculus bovis sativus，CBS；曾译名in vitro cultivated calculusbovis，ICCB）是模拟体内胆结石形成的原理和生化过程，在体外牛胆汁内培育的牛胆红素钙结石，其性状、结构、成分、含量、药效及疗效等与天然牛黄一致。批准文号国药准字20010075，已收载入2005年药典（一部）。实验以CBS为对象，以蟾蜍坐骨神经干和三叉神经节细胞为标本，观察CBS对复合动作电位及电压依赖性总钠通道电流(INa-T)、TTX不敏感型钠通道电流(INa-TTX-r)及电压依赖性钙通道电流(ICa)的影响，探讨牛黄镇痛作用的电生理机制，以证实其阻滞痛觉信息传导的推测。1．CBS对蟾蜍坐骨神经干复合动作电位的影响方法：复合动作电位记录法结果：0．4 mg·mL-1 CBS能轻度抑制蟾蜍坐骨神经干复合动作电位的幅度，30 min时使动作电位由给药前的2．68±0．26 mV下降为给药后的2．55±0．29 mV，抑制率为5．0±2．4％（n=7，P＞0．05）。4 mg·mL-1 CBS可时间依赖性的显著抑制动作电位，给药后10 min、20 min和30 min时，对动作电位的抑制率分别为21．3±10．3％、36．8±14．2％、42．5±17．6％（n=8，P＜0．01），用任氏液冲洗10～20 min可使动作电位部分恢复。同样条件下，给予0．02％利多卡因10 min、20 min和30 min时，动作电位分别下降26．8±14．9％、48．0±19．1％和60．7±14．2％（n=6，P＜0．05）。溶剂对照组对动作电位无明显影响。2．CBS对大鼠三叉神经元总钠通道电流(INa-T)的影响方法：全细胞膜片钳记录结果：溶剂对照对于TRG细胞INa-T无明显影响。CBS能够剂量依赖性的抑制TRG细胞的总钠电流幅值，0．2、2、20μg·mL-1CBS可使神经元钠电流幅值分别减少25．9±5．7％、45．0±7．6％和55．8±7．8％（n=6，P＜0．01）。20μg·mL-1CBS使INa由给药前的12．2±0．7 nA减少至给药后的5．4±0．9 nA，但冲洗后电流未见明显恢复（5．6±1．0 nA，P＞0．05），提示药物作用难以逆转。以INa幅值对应各测试电位作图，得INaI-V曲线。各测试电压下，CBS使INa-T幅值减小，给药前后最大激活电位及激活阈值电位无改变。根据所记录到的INa，用Boltzmann函数拟合比较激活曲线发现：给药前半数激活电压V1/2=-19．0±10．6 mV，k=4．3±1．7，给予20μg·mL-1CBS后V1/2=-24．5±10．3 mV，k=4．9±2．5（n=6，P＞0．05），表明20μg·mL-1CBS对INa-T的激活动力学无明显影响。3．CBS对大鼠三叉神经元TTX不敏感型钠通道电流(INa-TTX-r)的影响方法：全细胞膜片钳记录结果：给药前INa-TTX-r幅值为10．2±0．2 nA，给予溶剂对照后为9．9±0．4 nA（n=5，P＞0．05），表明溶剂对TRG细胞INa-TTX-r无明显影响。CBS可剂量依赖性的抑制TRG细胞INa-TTX-r幅值，0．2、2、20μg·mL-1CBS可使TRG细胞INa-TTX-r幅值分别减少8．1±2．0％、28±5．2％和39．3±5．7％（n=6，P＜0．01）。20μg·mL-1CBS使INa-TTX-r幅值由给药前的11．4±1．4 nA减少至给药后的6．9±0．6 nA，冲洗后电流同样未见明显恢复（6．8±0．8 nA，P＞0．05）。INa-TTX-r给药前后的I-V曲线显示，在各测试电压下CBS可使INa-TTX-r幅值减小，对I-V曲线的形状无明显影响。比较给药前后电流的激活曲线发现：给药前半数激活电压V1/2=-24．1±0．2 mV，k=1．6±0．1，给予20μg·mL-1CBS后V1/2=-23．0±1．4 mV，k=1．6±0．2（n=6，P＞0．05），表明20μg·mL-1CBS对TRG细胞INa-TTX-r的激活时间过程无明显影响。4．CBS对大鼠三叉神经元细胞电压依赖性钙通道电流(ICa)的影响方法：全细胞膜片钳记录结果：0．05％溶剂对照对于TRG细胞ICa无明显影响。CBS能够剂量依赖性的抑制TRG细胞电压依赖性钙电流幅值，0．2、2、20μg·mL-1CBS可使神经元钙电流幅值分别减少303±4．7％、41．9±3．6％和56．7±6．8％（n=6，P＜0．01）。20μg·mL-1CBS使ICa由给药前的5．7±0．9 nA减少至给药后的2．5±0．4 nA，但冲洗后电流未见明显恢复（2．4±0．6 nA，P＞0．05），提示药物作用难以逆转。ICaI-V曲线显示，各测试电压下，CBS使ICa幅值减小，给药前后最大激活电位及激活阈值电位无改变。比较给药前后电流的激活曲线发现：给药前半数激活电压V1/2=-15．5±3．2m V，k=3．4±0．8，给予20μg·mL-1CBS后V1/2=-12．3±4．6 mV，k=4．5±0．6（n=6，P＞0．05），表明20μg·mL-1CBS对ICa的激活动力学无明显影响。比较给药前后ICa的稳态失活曲线发现：给药前半数失活电压V1/2=-36．3±4．5 m V，k=21．4±5．4，给予20μg·mL-1CBS后V1/2=-33．5±5．8mV，k=18．5±4．3（n=6，P＞0．05），表明20μg·mL-1CBS对ICa的失活动力学无明显影响。结论：CBS对电压依赖性钠电流和钙电流的阻滞作用可能是其镇痛作用的机制之一。

论文目录

• 缩写词表
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• Abstract
• 第一部分 二苯乙烯苷对阿霉素心脏毒性的体内外保护作用及机制
• 前言
• §1.THSG对小鼠急性阿霉素心脏毒性的保护作用及机制
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 参考文献
• §2.THSG对阿霉素损伤心肌细胞的保护作用及机制
• 1.试剂与设备
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 参考文献
• 第二部分 体外培育牛黄镇痛作用的电生理机制研究
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 参考文献
• 综述
• 附录 攻读博士期间发表的论文
• 致谢