利用秀丽隐杆线虫筛选可下调Ras/MAPK通路过度激活的鬼臼毒素衍生物

论文摘要

鬼臼毒素（podophyllotoxin）衍生物,例如依托泊苷（Etoposide, VP-16）具有显著的抗肿瘤活性,是临床上治疗多种肿瘤的重要药物。但是,鬼臼毒素衍生物存在毒副反应大,易产生抗药性等问题,限制了它们的使用。人们用化学方法不断合成鬼臼毒素系列化合物,希望可以从中找到新的替代药物。本文利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans,简写C. elegans）筛选本实验室合成的10种能够下调Ras/MAPK信号通路过度激活的鬼臼毒素衍生物,以期得到活性好毒性小新的化合物。鬼臼毒素衍生物水溶性通常较差,本文首先参考依托泊苷注射液（Etoposide Injection）的溶媒配方调整溶剂的浓度,结果显示a （1.0%）、b （20 g/L）、c （0.2%）、d （1.6%）时能很好的溶解依托泊苷粉末,且不会干扰鬼臼毒素衍生物的活性评价结果。依托泊苷属于鬼臼毒素衍生物,本文经实验证明依托泊苷注射液可显著地下调Ras/MAPK信号通路过度激活,所以本文以依托泊苷注射液为阳性对照,利用秀丽隐杆线虫评价10种鬼臼毒素衍生物的活性,结果表明400μM的化合物p-07与1000μM的化合物p-10具有相似的活性,均能很好的下调Ras/MAPK信号通路过度激活。本文通过分析p-07,p-10和阳性对照依托泊苷注射液对线虫的真阴门位置、体长、体宽和发育的影响来评价毒性,结果显示：依托泊苷注射液会影响秀丽隐杆线虫的真阴门位置,造成一定的致畸作用；化合物p-07除了对线虫的真阴门位置有影响外,还会使线虫发育迟缓；化合物p-10会造成线虫体长变短,体宽变窄和发育迟缓。最后,本文对这两种化合物的活性进行验证,体外观察化合物p-07、p-10和依托泊苷注射液对拓扑异构酶II的抑制作用,结果表明：化合物p-07和p-10与依托泊苷注射液相同,都能够很好的抑制拓扑异构酶II的活性,且抑制活性相似。结论：依托泊苷注射液活性评价实验证明利用秀丽隐杆线虫筛选具下调Ras/MAPK信号通路过度激活的鬼臼毒素衍生物是可行的,且得到两种活性较好的化合物（p-07和p-10）,它们的活性在体外也得到了验证,但这两种化合物的毒性较大,尤其表现在对线虫发育的影响上。另外,通过分析本实验室合成的化合物的构效关系,发现反式内酯环构型改变的同时4位不饱和有利于提高鬼臼毒素衍生物的活性。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 1 鬼臼毒素衍生物简介
• 1.1 鬼臼毒素衍生物的药用及毒性
• 1.2 鬼臼毒素衍生物的化学合成
• 1.3 鬼臼毒素构效关系研究
• 2 肿瘤模式生物的应用
• 2.1 肿瘤模式生物简介
• 2.2 秀丽隐杆线虫作为肿瘤模式生物的应用
• 2.2.1 秀丽隐杆线虫简介
• 2.2.2 秀丽隐杆线虫作为肿瘤模式生物的应用
• 3 秀丽隐杆线虫作为药物毒性评价模型的应用
• 4 课题提出
• 第二部分 鬼臼毒素衍生物溶媒的研究
• 1 材料和试剂
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要仪器
• 1.3 实验药品
• 1.4 实验试剂
• 1.5 培养基及缓冲液
• 2 方法
• 2.1 鬼臼毒素衍生物的溶解
• 2.2 线虫培养
• 2.2.1 大肠杆菌OP50的培养
• 2.2.2 线虫的培养
• 2.3 溶剂对线虫的影响
• 2.3.1 溶剂对线虫的影响
• 2.3.2 溶剂对线虫影响的观察
• 2.4 数据处理
• 3 结果与分析
• 3.1 依托泊苷粉末的溶解
• 3.2 线虫的野生型和突变体表型
• 3.3 溶剂对线虫表型的影响
• 4 讨论
• 第三部分 阳性对照的选择及鬼臼毒素衍生物的活性筛选
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 仪器
• 1.3 化合物
• 1.4 试剂
• 2 方法
• 2.1 依托泊苷注射液下调Ras/MAPK信号通路过度激活的活性
• 2.2 鬼臼毒素衍生物下调Ras/MAPK信号通路过度激活的活性筛选
• 2.3 数据处理
• 3 结果及分析
• 3.1 依托泊苷注射液下调Ras/MAPK信号通路过度激活的活性
• 3.2 鬼臼毒素衍生物下调Ras/MAPK信号通路过度激活的活性筛选
• 3.2.1 化合物p-02对线虫的作用
• 3.2.2 化合物p-03对线虫的作用
• 3.2.3 化合物p-04对线虫的作用
• 3.2.4 化合物p-05对线虫的作用
• 3.2.5 化合物p-06对线虫的作用
• 3.2.6 化合物p-07对线虫的作用
• 3.2.7 化合物p-08对线虫的作用
• 3.2.8 化合物p-09对线虫的作用
• 3.2.9 化合物p-10对线虫的作用
• 3.2.10 化合物p-11对线虫的作用
• 4 讨论
• 第四部分 化合物p-07和p-10的毒性评价
• 1 材料与试剂
• 1.1 药品
• 1.2 实验动物
• 1.3 仪器
• 1.4 试剂
• 2 方法
• 2.1 两种化合物对线虫体长的影响
• 2.2 两种化合物对线虫体宽的影响
• 2.3 两种化合物对线虫阴门位置的影响
• 2.4 两种化合物对线虫成熟率的影响
• 2.5 数据处理
• 3 结果与分析
• 3.1 两种化合物对线虫体长的影响
• 3.2 两种化合物对线虫体宽的影响
• 3.3 两种化合物对线虫真阴门位置的影响
• 3.4 两种化合物对线虫发育的影响
• 4 讨论
• 第五部分 p-07和p-10体外对拓扑异构酶Ⅱ的抑制作用
• 1 材料与试剂
• 1.1 药品
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 2 方法
• 2.1 DNA提取实验
• 2.1.1 质粒转化实验
• 2.1.2 质粒的培养及验证
• 2.2 DNA拓扑异构酶Ⅱ的活性测定
• 2.3 依托泊苷注射液对拓扑异构酶Ⅱ的抑制作用
• 2.4 p-07和p-10对拓扑异构酶Ⅱ的抑制作用
• 3 结果与分析
• 3.1 质粒的验证
• 3.2 DNA拓扑异构酶Ⅱ的活性测定
• 3.3 依托泊苷注射液对拓扑异构酶Ⅱ的抑制作用
• 3.4 化合物p-07对拓扑异构酶Ⅱ的抑制作用
• 3.5 化合物p-10对拓扑异构酶Ⅱ的抑制作用
• 4 讨论
• 第六部分 结论
• 参考文献
• 致谢