注射用重组人CTLA4-抗体融合蛋白Ⅰ期临床试验

论文摘要

注射用重组人CTLA4-抗体融合蛋白是一种由人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4）胞外区和人免疫球蛋白G1（IgG1）修饰的Fc片段（铰链区、CH2和CH3区）相连接的融合蛋白。它是一种选择性共刺激调节剂,它与抗原提呈细胞上的B7分子的亲和力大大高于T细胞表面的CD28,可以封闭抗原提呈细胞上的B7,阻断CD28与之结合,从而阻断共刺激通路,抑制T细胞（T淋巴细胞）激活。T淋巴细胞的激活与类风湿关节炎（RA）的病理进程相关。在RA患者的关节腔滑液中可以找到激活的T淋巴细胞。根据我国药品食品监督管理局（SFDA）通过的《药品注册管理办法》,注射用重组人CTLA4-抗体融合蛋白属于生物制品7类,即已在国外上市销售但尚未在国内上市销售的生物制品。目的:建立酶联免疫吸附测定（ELISA）法测定人血浆中重组人CTLA4-Ig浓度的方法,进行单次给药后重组人CTLA4-Ig在健康人体内的耐受性和药代动力学研究,为指导临床制定安全、合理的用药方案提供理论依据,为新药审批和临床用药提供试验依据,并为Ⅱ期临床研究提供参考依据。方法:本研究分以下三部分:第一部分建立灵敏度高、专一性强、准确性好、重复性强的ELISA法测定人血浆中rhCTLA4-Ig的分析方法学。测定步骤:将鼠抗人CTLA4单抗用包被缓冲液按比例稀释,包被96孔酶标板,4℃孵育18小时;加包被缓冲液室温封闭2小时;用洗涤液洗板;加入不同稀释浓度的标准品和稀释好的待测样品;加样后立即加入稀释好的生物素标记的二抗。酶标板置于摇床中连续振摇,室温孵育2小时。加入按比例稀释好的HRP标记的链酶亲和素。酶标板置于摇床中连续振摇,室温孵育0.5小时。避光条件下加入HRP显色液,室温反应15分钟。加终止液,终止反应后0.5小时内酶标仪读取450 nm的吸光度（A）值,记录结果。每份样品重复测定,各药盒都设置标准校正曲线,用以计算未知样品浓度。第二部分考察单次静脉滴注rhCTLA4-Ig（1～20 mg·kg-1）在健康受试者体内的耐受性。随机选取27名健康志愿者,年龄、体重、身高均符合试验要求,常规体检、心电图检查,实验室检查包括血、尿常规,肝、肾功能等各项生化检查均无异常,无其它系统性疾病及药物过敏史。3个月内未参加过临床试验,试验前两周内及试验期间未服用其他任何药物。试验中随时观察受试者症状、体征以及各种不良反应,并定期进行实验室检查（血尿常规、肝肾功能、血液生化及血沉等）。综合评价rhCTLA4-Ig在健康人体内的耐受性,整个试验期间配备有经验的医师和护士监护。所有计量资料均采用Excel或SPSS软件进行计算,以?X±SD表示,并进行t检验或方差分析。第三部分研究单次静脉滴注rhCTLA4-Ig（1～20 mg·kg-1）在健康受试者体内的药代动力学特征。27名健康受试者随机平行分为低、中、高3个单次给药剂量组。按实验设计要求,27名受试者于试验当日晨按分组分别静脉滴注重组人CTLA4-抗体融合蛋白1 mg·kg-1、10 mg·kg-1、20 mg·kg-1,输液在（60±5）分钟内完成,而后按设计的采血时间点采血。分别于静脉滴注前、滴注开始第30分钟,滴注结束后0、2、4、12、24小时、2、3、4、7、14、28、42、56、70和84天各取血2 ml,置于15 % EDTA抗凝的试管内,3600 r·min-1离心分离血清至另一无菌试管中,-80℃保存,待测。本试验采用ELISA法测定血浆中rhCTLA4-Ig的浓度。采用DAS2.1软件计算主要药代动力学参数,Tmax、Cmax采用实测值,AUC用公式计算。所有的数据均用几何均数±标准差（?X±SD）表示,采用单因素ANOVA和Student’s t test进行统计学分析。结果:1. 27名健康受试者,均完成试验。单次给药耐受性试验观察至84 d。试验期间,全部试验的27名受试者应用不同剂量药物后均未有明显的不良反应发生;呼吸、心率、血压、脉搏、体温等生命体征未见异常;心电图正常。注射药物局部未发现皮肤红肿、瘀斑或皮疹等刺激性反应,试验观察期间未出现不适反应和异常体征。2.单次静脉滴注rhCTLA4-Ig 1、10和20 mg·kg-1后观察至84 d。试验过程中共进行七次血液生化指标检查。27名健康受试者用药前后血沉检查未发现异常改变,经t检验,各指标试验前后比较均无显著差异。试验前后进行尿常规指标检测,所有健康受试者尿常规指标无异常改变。3.本试验采用ELISA法测定健康志愿者血浆中rhCTLA4-Ig浓度,最低检测限为0.4 ng·mL-1,线性范围为1.95～500 ng·mL-1。本药在此线性范围内重现性好,CV %均小于10 %,准确度在-5.3～-1.1 %之间;不同药盒的批间精密度CV %也均小于10 %,准确度在0.6～6.2 %之间。4.单次静脉滴注rhCTLA4-Ig 1、10和20 mg·kg-1后的药代动力学参数:T1/2ke分别为（15.13±2.62）,（14.21±2.35）和（11.77±1.24）d;MRT分别为（19.913±2.086）、（19.630±1.832）和（18.795±0.832）d;AUC（0-84d）分别为（170.64±27.75）、（1490.26±231.23）和（2977.25±362.31）μg·d·mL-1;Tmax均为0.0416 d;Cmax分别为（18.39±1.57）（,186.91±24.70）和（416.84±34.40）μg·mL-1。结论:1. ELISA的分析方法具有灵敏度较高,准确性好,专一性较强,操作简便快捷、可重复性强的特点。高、中、低三种浓度样品-80℃冻存一个月后,CTLA4-Ig稳定性良好,与未经冻存的样本相比,统计学无显著性差异。适用于人体血浆中rhCTLA4-Ig的定量分析。2.试验表明健康受试者单次静脉滴注国产rhCTLA4-Ig在1～20 mg·kg-1剂量范围内是安全的,耐受性良好,未见不良反应发生。3.用本方法测定受试者血浆rhCTLA4-Ig浓度,内源性抗CTLA4-Ig抗体干扰低于LOQ。血药浓度随注射剂量增高而升高。各剂量组的药代动力学参数基本一致。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 类风湿性关节炎治疗药物的研究进展
• 1. 类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）的定义
• 2. 治疗类风湿性关节炎药物分类
• 3. 结语
• 新型生物制剂—rhCTLA4-Ig的研究进展
• 1. 分子生物学结构
• 2. CTLA4-Ig 的免疫抑制机理
• 3. 临床药理学
• 4. 药物相互作用
• 5. 不良反应
• 6. 展望
• 正文
• 引 言
• 第一部分 建立ELISA法测定人血浆中重组人CTLA4-抗体融合蛋白浓度的分析方法学
• 1 材料与方法
• 1.1 药品和仪器
• 1.2 方法
• 2 测定方法
• 2.1 测定原理
• 2.2 试剂和材料配置
• 2.3 测定步骤
• 3 分析法方法验证及结果
• 3.1 ELISA法测定血浆rhCTLA4-Ig的特异性
• 3.2 血浆中CTLA4-Ig标准曲线制备及定量下限（LOQ）的确定
• 3.3 精密度和准确度
• 3.4 稳定性考察和回收率
• 3.5 测定方法的质量控制
• 4 讨论
• 第二部分 注射用重组人CTLA4-抗体融合蛋白单剂量给药在健康人体内的耐受性研究
• 1 对象和方法
• 1.1 试验对象
• 1.2 试验药品
• 1.3 试验原则
• 1.4 试验分组及给药剂量的确定
• 1.5 药物配制方法
• 1.6 试验设计
• 1.7 观察指标及检测方法
• 1.8 安全性指标观察
• 1.9 一般临床症状及不良反应观察
• 1.10 统计学方法
• 2 试验结果
• 2.1 受试者一般情况分析
• 2.2 血液生化检查结果
• 2.3 血、尿常规检查结果
• 2.4 试验过程中血沉指标的变化结果分析
• 3 讨论
• 第三部分 注射用重组人CTLA4-抗体融合蛋白单剂量给药在健康人体内的药代动力学研究
• 1 对象和方法
• 1.1 试验对象
• 1.2 受试者纳入、排除及试验终止标准
• 1.3 试验药物、试验分组及试验原则
• 1.4 试验设计和方法
• 1.5 统计分析
• 2 结果
• 2.1 方法学
• 2.2 质控样品测定
• 2.3 药-时曲线
• 2.4 药代动力学参数
• 2.5 不良反应观察
• 3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢