酶膜反应器水解酪蛋白连续制备ACE抑制肽的研究

论文摘要

本论文研究了以牛乳酪蛋白为原料,通过将酶解反应与膜分离相耦合高效、经济、连续地水解酪蛋白制取血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽的技术。本文首先进行了水解用蛋白酶的筛选及酶解条件的优化。以酶解液的ACE抑制率、蛋白质得率为指标,通过单酶和双酶复合水解的相互综合比较,确定了以中性蛋白酶作为本试验的水解用酶,并采用正交试验进行酶解条件的优化,得到酶解反应的最佳条件为:水解温度为40℃,pH值为7.0,酶用量为2000 U/g,底物浓度为8%（w/v）,酶解时间为2h。继而本文研究了将酶解与膜分离耦合连续制备ACE抑制肽的方法。通过综合考察超滤膜包对原料蛋白质的截留、对酶的截留、膜通量以及膜包滤出液的ACE抑制活性,确定了以截留分子量（MWCO）5k的再生纤维素膜包作为试验用的膜包,并通过优化得到了超滤条件为操作压力0.1MPa,底物浓度8%（w/v）;在此基础上采用静态间歇式反应、半连续反应和连续反应3种不同的模式进行ACE抑制肽的制备,结果表明静态反应的得率、单位时间产量和单位活力酶对应的产量远小于半连续和连续反应,其中连续反应的得率达到43.4%,单位时间产量为6284 mg/h,单位活力酶对应的产量为0.23 mg/U,产物的ACE抑制率达到了81.6%（1mg/mL）,整个系统能持续稳定反应8h以上;所得的ACE抑制肽产物经肠道蛋白酶消化后,ACE抑制率升高,测得其IC50值为0.189 mg/mL,是同等条件下测得的卡托普利的IC50值（0.00035 mg/mL）的540倍。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1 前言
• 1.1 血管紧张素转化酶与高血压
• 1.2 ACE对血压的调节机理
• 2 ACE抑制肽
• 2.1 ACE抑制肽的分类
• 2.2 食品蛋白质来源的ACE抑制肽
• 2.2.1 乳蛋白来源的ACE抑制肽
• 2.2.2 其他食品来源的ACE抑制肽
• 2.3 ACE抑制肽的评价方法
• 2.3.1 动物试验（体内检测）
• 2.3.2 体外检测
• 3 ACE抑制肽的制备及分离纯化
• 3.1 ACE抑制肽的制备方法
• 3.2 ACE抑制肽的分离和纯化
• 3.2.1 超滤分离
• 3.2.2 层析分离
• 3.3 用酶膜反应器分离制备ACE抑制肽
• 3.3.1 酶膜反应器的优点
• 3.3.2 酶膜反应器在多肽制备中的应用
• 4 研究内容简介
• 4.1 酶的选择及酶解条件的优化
• 4.2 ACE抑制肽的连续制备
• 第二章 酶的选择及酶解条件的优化
• 1 引言
• 2 材料，试剂和设备
• 2.1 材料和试剂
• 2.2 仪器设备
• 3 试验方法
• 3.1 分析检测方法
• 3.1.1 蛋白酶活力的测定（福林酚法）
• 3.1.2 蛋白质含量的测定—半微量凯氏定氮
• 3.1.3 蛋白质回收率的测定
• 3.1.4 水解度的测定
• 3.1.5 ACE抑制活性的检测方法（HPLC法）
• 3.2 试验步骤
• 3.2.1 水解用酶的筛选
• 3.2.2 酶解条件的优化
• 3.2.3 双酶水解
• 4 结果与讨论
• 4.1 蛋白酶活力的测定
• 4.2 水解用酶的筛选
• 4.2.1 各种蛋白酶酶解液ACE抑制率随时间的变化
• 4.2.2 各种蛋白酶酶解液的水解度随时间的变化
• 4.2.3 得率随时间的变化
• 4.2.4 水解用酶及水解时间的确定
• 4.3 酶解条件的优化
• 4.3.1 正交试验
• 4.3.2 双酶水解
• 5 本章小结
• 第三章 ACE抑制肽的连续制备
• 1 引言
• 2 材料，试剂和设备
• 2.1 材料和试剂
• 2.2 仪器设备
• 3 试验方法
• 3.1 分析检测方法
• 3.1.1 蛋白酶活力的测定
• 3.1.2 蛋白质含量的测定
• 3.1.3 膜通量的测定
• 3.1.4 ACE抑制活性的检测方法
• 50)的计算'>3.1.5 ACE抑制肽半抑制浓度(IC₅₀)的计算
• 3.1.6 ACE抑制肽的稳定性实验
• 3.1.7 CPPs含量测定方法
• 3.1.8 肽的分子量分布的测定
• 3.2 试验步骤
• 3.2.1 超滤膜包的选择
• 3.2.2 超滤条件的优化
• 3.2.3 水解与分离进程曲线的绘制
• 3.2.4 半连续反应
• 3.2.5 连续反应
• 3.2.6 ACE抑制肽的进一步分离及稳定性试验
• 4 结果与讨论
• 4.1 超滤膜包的选择
• 4.1.1 不同膜包对蛋白质的截留和透过情况
• 4.1.2 不同膜包对酶的截留和透过情况
• 4.1.3 测量不同膜包的膜通量
• 4.1.4 比较不同膜包滤出液的ACE抑制率
• 4.1.5 超滤膜包的确定
• 4.2 超滤条件的优化
• 4.2.1 操作压力对酶活力及膜通量的影响
• 4.2.2 料液浓度对膜通量及得率的影响
• 4.3 水解与分离进程曲线的绘制
• 4.3.1 滤出液中蛋白质浓度随时间的变化情况
• 4.3.2 膜通量随时间的变化情况
• 4.3.3 酶的活力随时间的变化情况
• 4.4 半连续反应
• 4.4.1 滤出液蛋白质浓度及体积随时间的变化
• 4.4.2 原始反应液中蛋白质的浓度变化情况
• 4.5 连续反应
• 4.5.1 滤出液的蛋白质浓度及膜通量随时间的变化
• 4.5.2 原始反应液蛋白质浓度的变化情况
• 4.6 静态、半连续及连续反应的比较
• 4.7 ACE抑制肽的进一步分离及稳定性试验
• 4.7.1 ACE抑制肽的进一步分离
• 4.7.2 ACE抑制肽的稳定性试验
• 4.8 超滤各部分分子量的分布
• 4.8.1 分子量小于5k部分的分子量分布
• 4.8.2 分子量小于1k部分的分子量分布
• 4.8.3 分子量大于1k小于5k部分的分子量分布
• 4.9 ACE抑制肽与卡托普利的比较
• 5 本章小结
• 第四章 结论与展望
• 参考文献
• 作者简历