甜黑米黑色种皮基因的图位克隆及功能分析

论文摘要

随着黑米食用价值和医用价值的发现,黑米越来越受到人们的喜爱和关注。但是由于其产量不高,种植也不广泛,致使它的推广和发展受到了严重抑制。对于黑色种皮形成机制的遗传学研究将有助于促进对于黑色种皮大米的生产和应用,为培育优质高产的黑米品种奠定坚实的理论基础。目前已有很多关于水稻种皮颜色遗传机制的报道,研究人员认为种皮颜色可能受一对、两对甚至多对基因控制,就它真正的遗传机制目前还没有一个统一的说法。本研究以具有黑色种皮的‘甜黑米’为研究材料,旨在通过图位克隆的方法获得控制黑色种皮合成的基因。水稻种皮是由子房壁发育而来,因此种皮的性状由母本的基因型决定。当以‘甜黑米’为母本,培矮64和日本晴分别为父本进行杂交,所获得的F1种子种皮均表现出黑色,并且在F2：3种子中发生分离,其中有色与无色的分离比为3：1。这表明黑色种皮性状受一对显性基因控制。运用甜黑米/培矮64的F2群体,通过图位克隆的方法将控制黑色种皮的基因初步定位于第4染色体的标记RM252与RM317之间,两者遗传距离为19.3cM。在此区段内进一步开发高密度的分子标记,最终将该基因精细定位于InDe1标记Ind4-18和M14之间42kb的范围内。基因预测结果显示,这一区间内共有7个候选基因,其中一个注释为与花青素合成相关的Ra基因,该基因与玉米中的Lc基因同源。对‘甜黑米’及一系列黑米及白米材料中的Ra基因进行了基因序列分析,发现白米较黑米而言,在预测的第7外显子处存在2bp的GT插入,这将导致白米中Ra基因翻译时发生移码,产生截短的蛋白。Ra基因编码一个Myc类的bHLH转录因子。转录水平的分析表明该基因主要在糙米中表达,随着胚乳的发育,表达量呈先增加后下降的趋势,在抽穗后第12天的糙米中表达量最显著。通过基因的功能互补验证我们已经初步证实Ra基因参与调控水稻种皮中花青素的合成,显性Ra基因能够弥补白米品种日本晴糊粉层的色素沉积缺陷,形成花青素沉积。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 黑米资源
• 1.1 黑米的起源
• 1.2 中国的黑米资源
• 1.3 中国的黑米育种研究及其育成品种
• 2 黑米的营养价值
• 2.1 黑米的营养成分
• 2.2 黑米的保健功效
• 3 黑米的种皮色素
• 3.1 类黄酮化合物
• 3.2 黑米种皮色素花青素
• 3.3 花青素的生物合成
• 3.4 花青素生物合成的主要结构基因
• 3.4.1 查尔酮合酶（chalcone synthase,CHS）
• 3.4.2 查尔酮异构酶（chalcone isomerase,CHI）
• 3.4.3 黄烷酮-3-羟化酶（flavanone-3-hydroxylase,F3H）
• 3.4.4 黄烷酮-3’-羟化酶（flavanone-3’hydroxylase,F3’H）
• 3.4.5 黄烷酮-3’5’-羟化酶（flavanone-3’5’hydroxylase,F3’5’H）
• 3.4.6 二氢黄酮醇-4-还原酶（dihydroflavonol-4-reductase,DFR）
• 3.4.7 花青素合酶（anthocyanidin synthesis,ANS）
• 3.5 花青素生物合成的调节基因
• 4 种皮颜色的遗传研究进展
• 4.1 种皮黑色素的遗传分析
• 4.2 种皮色素相关基因的定位
• 4.3 Ra基因的相关基因的报道
• 5 本研究的目的和意义
• 第二章 黑色种皮基因的定位
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料与群体构建
• 1.2 性状调查
• 1.3 叶片基因组DNA的提取
• 1.4 分子标记的筛选及初步定位
• 1.5 分子标记的自行开发及精细定位
• 1.5.1 InDel标记的开发
• 1.5.2 CAPs标记的开发
• 1.6 基因预测
• 2 结果与分析
• 2.1 分子标记的开发
• 2.2 甜黑米黑色种皮性状的遗传分析
• 2.2.1 黑色种皮的遗传机制
• 2.2.2 黑色种皮基因的初定位及其验证
• 2.3 黑色种皮基因的精细定位
• 2.4 基因预测与候选基因分析
• 3 讨论
• 第三章 候选基因RA的克隆、表达谱及功能分析
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 叶片基因组DNA的提取
• 1.3 各组织中RNA的提取
• 1.4 Ra基因的序列分析
• 1.5 Ra基因的多态性差异分析
• 1.6 Ra基因的关联分析
• 1.7 Ra基因的表达分析
• 1.8 载体构建
• 1.8.1 Ra表达载体的构建
• 1.8.2 Ra过表达载体的构建
• 1.8.3 Ra干扰载体的构建
• 1.8.4 Ra promoter-GUS表达载体的构建
• 1.8.5 细胞定位载体的构建
• 1.9 农杆菌介导植物基因转化水稻程序
• 1.9.1 诱导水稻愈伤组织
• 1.9.2 农杆菌介导植物基因转化
• 1.10 Ra基因的瞬时表达
• 1.10.1 种子的处理
• 1.10.2 金粉微弹的制备
• 1.10.3 质粒DNA包被微弹（2枪）
• 1.10.4 轰击及培养
• 2 结果与分析
• 2.1 Ra基因的测序与关联分析
• 2.1.1 Ra基因的序列分析
• 2.1.2 Ra基因的关联分析
• 2.2 Ra基因的表达分析
• 2.3 Ra基因的功能互补验证
• 2.3.1 载体的构建
• 2.3.2 Ra基因的瞬时表达
• 2.3.3 转基因结果
• 3 讨论
• 第四章 全文结论
• 1 黑色种皮基因的遗传分析
• 1.1 黑色种皮的遗传机制
• 1.2 黑色种皮基因的图位克隆
• 2 候选基因RA的克隆与表达分析
• 2.1 Ra基因的序列分析
• 2.2 Ra基因的表达分析
• 2.3 Ra基因的功能互补验证
• 参考文献
• 附录
• 1 总DNA的提取（SDS法）及检测
• 1.1 溶液配制
• 1.2 DNA提取步骤
• 1.3 DNA浓度及质量的检测
• 2 PCR分析及SSR标记检测
• 2.1 PCR试剂
• 2.2 PCR反应
• 2.3 PCR产物的检测
• 2.3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.3.2 琼脂糖凝胶电泳
• 3 植物总RNA的提取
• 3.1 RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒提取水稻总RNA
• 4 质粒提取与连接转化的方法
• 4.1 质粒提取方法
• 4.2 连接反应与转化
• 致谢