胆固醇氧化酶的异源表达和应用研究

论文摘要

胆固醇氧化酶是胆固醇降解过程中的关键酶,能够专一性地将胆固醇氧化为胆甾酮,在食品开发、医疗保健、临床检测、生物农药等方面具有巨大的应用价值。胆固醇氧化酶主要来源于微生物,已发现的能够产生胆固醇氧化酶的微生物有节杆菌Arthrobacter,甾短杆菌Brevibacterium sterolicum,分枝杆菌Mycobacterium,诺卡氏菌Nocardia erythropolis,假单胞菌Pseudomonas,红球菌Rhodococcus等。本实验室已经筛选到一株能够产生胆固醇氧化酶的菌株,博德特氏菌Bordetella sp.B4,在此基础上进行了以下研究：1.胆固醇氧化酶基因的克隆和在大肠杆菌中的表达克隆得到了Bordetella sp.B4中的胆固醇氧化酶基因Bcod。测序结果表明,Bcod全长1656 bp,与短杆菌（Brevibacterium sp.DGCDC-82,Brevibacterium sterolicum）、节杆菌（Athrobacter sp.F2）、马红球菌（Rhodococcus equi）中胆固醇氧化酶基因的序列同源性达到99%。将Bcod基因插入pET-22b（+）载体,转化E coli Rosetta（DE3）,得到的重组菌R/Bcod在IPTG诱导下能够产生大小约为59 kDa的胆固醇氧化酶（BCOD）,但是在37℃诱导产生的BCOD多以没有活性的包涵体形式存在。通过对R/Bcod的诱导条件进行优化,最终确定在诱导温度为20℃,IPTG浓度为0.025 mM的条件下诱导8h能够得到最大BCOD酶活产量,约为350 U/L2.共表达分子伴侣提高重组E coli中活性胆固醇氧化酶的产量将已构建好的pET-Bcod重组质粒和分子伴侣GroEL.GroES的表达载体pACYC-me共同转化入E coli BL21（DE3）,得到重组菌株BL21/mc/Bcod。通过优化诱导条件,在20℃、IPTG浓度为1 mM的条件下诱导18h,BL21/mc/Bcod中活性BCOD的产量可以达到1000 U/L,比单独表达BCOD的对照重组菌BL21/Bcod的最高酶活产量（450 U/L）提高了1.2倍。用SDS-PAGE分析两株菌中包涵体蛋白产生情况,发现在BL21/mc/Bcod中包涵体蛋白大大减少。以上结果说明,BCOD与分子伴侣蛋白GroEL、GroES共表达减少了重组菌中不溶的、无活性的BCOD的产生,促进了可溶的、有活性的BCOD的产生。对BL21/mc/Bcod中的BCOD进行了纯化,纯化后的BCOD在SDS-PAGE凝胶上显示一大小约为59 kDa的单一电泳条带。对纯酶BCOD的酶学性质进行分析发现,重组BCOD的最适作用温度和pH分别为40℃和pH 7；与原菌中BCOD相比,温度稳定性和对底物胆固醇的亲和力有所下降,Ag+的抑制作用减弱,而Cu2+对BCOD有激活作用。3.胆固醇氧化酶在乳酸乳球菌中的表达利用乳酸乳球菌的NICE表达系统,构建了诱导表达BCOD的重组乳酸乳球菌LSc。通过单因子优化实验,确定在LSc菌体浓度为OD600=0.4时,添加终浓度为4 ng/mL的nisin,在20℃诱导8 h,BCOD产量达到340 U/L。对LSc中BCOD粗酶的酶学性质进行分析,发现其最适作用温度和pH分别为37℃和pH 7；BCOD粗酶在pH 5-10范围内非常稳定；Ag+对BCOD酶活有较强的抑制作用,Cu2+则有激活作用。4.重组乳酸乳球菌LSc降解胆固醇的研究对LSc在诱导条件下对培养基中添加的胆固醇的降解效果以及LSc粗酶液对鸡蛋黄中胆固醇的降解效果进行了研究。结果发现,在培养基中添加110μg/mL胆固醇时,经LSc作用24 h、48 h、72 h后,胆固醇的降解率分别为20%、47%、67%；在处理液中添加蛋黄使胆固醇浓度为1260μg/mL时,在0.5 M NaCl存在条件下,用LSc粗酶液作用24 h、48 h、72 h后,胆固醇的降解率分别为40%、70%、80%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 研究背景和立题依据
• 1.1 胆固醇氧化酶概述
• 1.1.1 胆固醇氧化酶的催化机制
• 1.1.2 胆固醇氧化酶的分类和来源
• 1.2 胆固醇氧化酶的异源表达
• 1.3 胆固醇氧化酶的应用
• 1.3.1 药物合成
• 1.3.2 临床检测
• 1.3.3 农业生产
• 1.3.4 食品开发
• 1.4 外源蛋白在E.coli中的可溶性表达
• 1.4.1 外源蛋白分泌表达
• 1.4.2 低温诱导表达
• 1.4.3 选择合适的宿主
• 1.4.4 向培养基中添加辅助因子
• 1.4.5 融合表达
• 1.4.6 目标蛋白与分子伴侣共表达
• 1.5 乳酸菌食品级诱导表达系统
• 1.5.1 NICE系统的构建原理
• 1.5.2 NICE系统的组成
• 1.5.3 NICE系统用于调控型基因表达的优点
• 1.6 本研究的立题依据和研究内容
• 1.6.1 立题依据
• 1.6.2 研究内容
• 第二章 胆固醇氧化酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株,质粒与培养基
• 2.2.2 仪器和试剂
• 2.2.3 引物设计
• 2.2.4 Bcod的扩增
• 2.2.5 克隆、测序与序列分析
• 2.2.6 表达载体的构建
• 2.2.7 重组大肠杆菌的构建
• 2.2.8 BCOD在重组大肠杆菌中的表达与检测
• 2.2.9 重组大肠杆菌的诱导条件优化
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 胆固醇氧化酶基因（Bcod）的克隆及序列分析
• 2.3.2 异源表达Bcod的引物设计
• 2.3.3 重组质粒pET-Bcod的构建
• 2.3.4 克隆载体的构建
• 2.3.5 载体的酶切和连接
• 2.3.6 连接液转化宿主菌及转化子的筛选
• 2.3.7 重组E.coli R/Bcod目的蛋白表达结果检测
• 2.3.8 诱导条件优化
• 2.4 讨论
• 第三章 胆固醇氧化酶和分子伴侣在大肠杆菌中的共表达
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 菌株、质粒和培养基
• 3.2.2 仪器和试剂
• 3.2.3 重组大肠杆菌的构建
• 3.2.4 BCOD的诱导表达
• 3.2.5 胞内蛋白表达情况的检测
• 3.2.6 酶活力测定
• 3.2.7 重组菌BL21/mc/Bcod表达BCOD的诱导条件优化
• 3.2.8 重组菌BL21/mc/Bcod中BCOD的纯化
• 3.2.9 重组菌BL21/mc/Bcod中BCOD的酶学性质分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 阳性转化子筛选及鉴定
• 3.3.2 BL21/mc/Bcod和BL21/Bcod的诱导条件优化
• 3.3.3 SDS-PAGE比较BL21/mc/Bcod和BL21/Bcod包涵体的产量
• 3.3.4 BL21/mc/Bcod中BCOD的纯化
• 3.3.5 BL21/mc/Bcod中BCOD的酶学性质分析
• 3.4 讨论
• 第四章 胆固醇氧化酶在乳酸乳球菌中的表达
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 菌株、质粒和培养基
• 4.2.2 仪器和试剂
• 4.2.3 重组乳酸乳球菌的构建
• 4.2.4 重组乳酸乳球菌的诱导
• 4.2.5 重组乳酸乳球菌LSc中BCOD表达情况的测定
• 4.2.6 LSc表达Beon的诱导条件优化
• 4.2.7 LSc粗酶液中BCOD酶学性质分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 克隆载体pMD18-T-Bcod的构建
• 4.3.2 表达载体pSEC-Bcod的构建
• 4.3.3 LSc中BCOD的表达情况分析
• 4.3.4 LSc的诱导条件优化
• 4.4 讨论
• 第五章 重组乳酸乳球菌LSc降解胆固醇的研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 菌株和培养基
• 5.2.2 仪器和试剂
• 5.2.3 LSc对培养基中胆固醇的降解实验
• 5.2.4 LSc粗酶液对鸡蛋黄中胆固醇的降解实验
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 LSc对培养基中胆固醇的降解实验
• 5.3.2 LSc粗酶液对鸡蛋黄中胆固醇的降解
• 5.4 讨论
• 全文总结与展望
• 参考文献
• 在读期间发表的论文
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表