MDA在植入前胚胎性别诊断中的应用

论文摘要

本研究的主要目的是建立单个细胞多重置换扩增的方法,对扩增产物进行多个基因座的分析,并将此方法应用于植入前胚胎,对其进行胚胎性别的植入前遗传学诊断。本研究分为两个部分。第一部分是MDA方法的建立及有效性检测。首先通过显微操作获取人的单个淋巴细胞,并按照细胞数不同分为1个细胞组、2个细胞组、5个细胞组和10个细胞组,共4组,每组16个样本。采用碱法裂解,多重置换扩增方法30℃恒温扩增2h,进行全基因组扩增,扩增产物片段长度>10kb,各组间MDA扩增成功率无统计学差异(P>0.05)。用荧光PCR方法对扩增产物进行16个基因座的STR分型,1个细胞组和2个细胞组间的基因座扩增成功率无差异,但小于5个细胞组和10个细胞组(75%,87.5% vs 100%,100%,P<0.05)。STR分型的准确率和ADO率在5个细胞组和10个细胞组之间没有统计学差异,其他各组间均有明显差异(P<0.05),STR分型的准确率1个细胞组<2个细胞组<5个细胞组和10个细胞组(79.37% vs 93.83%vs 98.91%,99.46%,P<0.05)。数据表明多重置换扩增后对产物进行STR分型的准确性随着起始细胞数的增多而增高,但1个细胞组STR分型的准确率仍可达79.37%,因此可以通过对单个细胞全基因组扩增后荧光PCR的方法对多个基医因座进行检测。第二部分是单卵裂球多重置换扩增后性别检测的研究。用第一部分中建立的单细胞多重置换扩增的方法对20个胚胎的共20个单卵裂球进行全基因组扩增,用荧光PCR检测SRY、AMEL、XHPRT、X22四个性别相关的基因座,检测胚胎性别,同时用同一胚胎另一卵裂球FISH结果作为对照。20个卵裂球MDA均扩增成功,扩增成功率100%。19个胚胎得到诊断,性别诊断成功率95%,其中12例为男性胚胎,7例为女性胚胎,与FISH结果一致率为95%,诊断准确率为95%。因此,可以用单卵裂球MDA后荧光PCR检测多个基因座的方法对胚胎性别进行快速、准确的植入前诊断。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、MDA方法的建立及有效性检测
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 实验对象
• 1.1.2 实验设备
• 1.1.3 实验试剂
• 1.1.4 实验分组
• 1.1.5 外周血DNA提取
• 1.1.6 淋巴细胞的制备
• 1.1.7 淋巴细胞的裂解
• 1.1.8 多重置换扩增
• 1.1.9 检测MDA扩增效果
• 1.1.10 STR分型
• 1.1.11 结果判断标准
• 1.1.12 统计学方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 MDA扩增产物的片断大小
• 1.2.2 MDA的扩增成功率
• 1.2.3 外周血DNA及各细胞组MDA后STR分型结果
• 1.2.4 1个细胞组和2个细胞组扩增失败基因座分析
• 1.3 讨论
• 1.3.1 多重置换扩增
• 1.3.2 单细胞PCR存在的问题
• 1.4 小结
• 二、单卵裂球MDA后性别检测的研究
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 实验对象
• 2.1.2 实验设备
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.4 胚胎解冻
• 2.1.5 单卵裂球的分离
• 2.1.6 单卵裂球的裂解
• 2.1.7 多重置换扩增
• 2.1.8 测定MDA产物的浓度和纯度
• 2.1.9 荧光PCR行性别基因座检测
• 2.2 结果
• 2.2.1 单卵裂球MDA扩增结果
• 2.2.2 性别基因座扩增结果
• 2.2.3 各性别基因座扩增成功率
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 植入前遗传学诊断技术的新进展
• 综述参考文献
• 致谢