盐生植物（补血草与盐地碱蓬）耐盐基因的发掘及应用

论文题目: 盐生植物（补血草与盐地碱蓬）耐盐基因的发掘及应用

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物学

作者: 郭善利

导师: 赵彦修,张慧

关键词: 盐生植物,补血草,盐地碱蓬,杨树,液泡膜焦磷酸酶,植物耐盐性和耐旱性

文献来源: 山东师范大学

发表年度: 2005

论文摘要: 土壤盐渍化是影响农林业生产,导致农林业生物量减少的主要非生物胁迫因子之一。盐分胁迫主要包括渗透胁迫、离子胁迫及其造成的一系列次级胁迫如氧化胁迫等,严重干扰植物体内业已存在的细胞及整株水平上的水分及离子稳态,造成植物细胞分子损伤,生长延滞甚至死亡。植物耐盐基因工程被认为是培育耐盐植物、开发利用盐碱荒地最有效、最经济的手段,但有效目的基因的缺乏,特别是来自盐生植物的耐盐基因,是限制植物耐盐基因工程发展的一大障碍。本论文的主要目的是利用真盐生植物补血草建立EST 数据库,结合盐生植物盐地碱蓬的EST 数据库,发掘来自盐生植物的耐盐基因,并且在林木模式植物杨树遗传转化方面做一些有益的尝试。1. 补血草(Limonium sinense)EST数据库的构建构建了一个补血草叶片的cDNA 文库,并从中随机挑选克隆单向测序,获得了1162 个EST序列,其中405 个EST序列与以前鉴定的基因序列具有很高的同源性。通过序列分析,鉴定了739 个独立的EST 序列,其中194 个序列与以前鉴定的基因具有同源性。所有的EST数据都将公布在GeneBank 的dbEST中。耐胁迫调控基因的EST划分为7 个主要的类别,占EST总数的3.4 %。2. 盐地碱蓬(Suaeda salsa)液泡膜焦磷酸酶基因的克隆与鉴定从400mmol/L NaCl处理的盐地碱蓬地上部分构建的λZap-cDNA文库中克隆了编码液泡膜H~+-PPase 的部分cDNA(SsVP),据已知序列设计引物利用PCR方法获得编码盐地碱蓬液泡膜H~+-PPase 的全长cDNA。对该基因的序列特征、基因组结构和在盐胁迫下的表达特性做了详细的分析。结果表明:SsVP 与已报道的红叶藜(Chenopodium rubrum)的液泡膜H~+-PPase 基因(CVP)同源性最高,Clustalx 软件对不同物种中液泡膜H~+-PPase 基因所作的系统进化分析表明SsVP与CVP 聚为一簇,均属于类型Ⅰ类液泡膜H~+-PPase;Southern杂交表明该基因在盐地碱蓬基因组中可能是多拷贝的;Northern杂交结果表明在盐胁迫和干旱胁迫下SsVP 的转录都是上行调节的,400mmol NaCl处理和干旱处理下,盐地碱蓬地上部分中SsVP 的mRNA增加。将SsVP 的全长cDNA克隆入植物表达载体pCAMBIA1300 中,导入根瘤农杆菌GV3101后,由花浸泡法进行拟南芥遗传转化,转化SsVP 的拟南芥在含潮

论文目录:

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英文摘要

第一部分文献综述

1 耐盐遗传基础问题

1.1 耐盐性遗传的早期研究

1.2 耐盐性遗传分析

1.2.1 分子标记(molecular marker)的应用

1.2.2 用转基因的方法研究植物耐盐性

1.2.2.1 过量表达(overexpression)某些基因研究植物耐盐性

1.2.2.2 基因沉默(gene silencing)

2 植物耐盐机制

2.1 植物对盐胁迫的反应及适应

2.1.1 植物对盐胁迫的反应

2.1.1.1 盐胁迫影响植物形态发育

2.1.1.2 盐胁迫影响植物的生理生化代谢

2.1.2 植物对盐胁迫的适应

2.1.2.1 泌盐

2.1.2.2 稀盐

2.1.2.3 拒盐

2.2 离子均衡及其调控

2.2.1 跨膜质子电化学梯度的重建

2.2.1.1 质膜H~+-ATPase

2.2.1.2 液泡膜H~+-ATPase

2.2.1.3 液泡膜H~+-PPase

2.2.1.4 液泡膜H~+-ATPase 和H~+-PPase 的关系

2.2.2 Na~+、K~+ 的稳态

2.2.2.1 Na~+ 跨膜内流与K~+ 吸收

2.2.2.2 Na~+ 的外排

2.2.2.3 Na~+ 的区隔化

2.2.2.4 K~+ 的稳态

2.2.3 Cl~-的吸收和区隔化

2.2.4 Ca~(2+) 的均衡

2.2.5 SOS 信号通路与离子稳态的调节

2.3 渗透平衡的重建及调节途径

2.3.1 渗透调节物质的合成及渗透平衡

2.3.2 与渗透平衡有关的调节途径

2.3.2.1 ABA 与渗透平衡调节

2.3.2.2 蛋白激酶途径

2.3.2.3 磷脂酶途径

3. 植物cDNA 文库构建与目的基因克隆

3.1 基因文库的分类

3.2 植物cDNA 文库构建的基本过程

3.3 EST 的概念与技术原理

3.3.1 EST 的概念

3.3.2 EST 的技术原理

3.3.3 EST 的应用

3.3.3.1 构建遗传学图谱与基因定位

3.3.3.2 分离与鉴定新基因

3.3.3.3 基因表达谱的研究

3.3.3.4 功能基因学和比较功能组学的研究

3.3.3.5 EST 在林木研究中的应用

4. 杨树抗性基因工程研究进展

4.1 林木基因转化技术

4.1.1 农杆菌介导法

4.1.2 DNA 直接导入法

4.2 杨树转基因研究应用

4.2.1 抗虫转基因研究

4.2.2 抗病转基因研究

4.2.3 抗除草剂转基因研究

4.2.4 抗盐和抗渗透胁迫转基因研究

4.2.5 材性改良和木质素基因转化研究

4.2.6 杨树其他基因的转化研究

4.3 杨树基因转化研究中存在的问题

第二部分实验论文

第一章补血草(Limonium sinense)EST 数据库的构建

1 实验材料

2 实验方法与步骤

2.1 补血草总RNA 的提取

2.2 Poly(A+) RNA 分离

2.3 cDNA 库构建

2.3.1 cDNA 第一链的合成

2.3.2 cDNA 第二链的合成

2.3.3 双链cDNA 末端补平

2.3.4 EcoRI 接头的加接

2.3.5 双链cDNA 末端的磷酸化和XhoI 酶切

2.3.6 胶回收目的片断

2.3.7 连接和转化

2.4 菌落PCR 检测

2.5 文库产品

2.6 质粒DNA 测序

2.7 序列编辑和BLAST 分析

2.7.1 GeneTool 分析

2.7.2 BLAST 分析

2.7.3 DNA alignment 分析

3 实验结果与分析

3.1 测序结果和BLAST 分析结果

3.2 耐胁迫基因ESTs

3.3 Digital Northern 分析和DNA alignment 分析结果

4 讨论

第二章盐地碱蓬(Suaeda salsa)液泡膜焦磷酸酶基因的克隆与鉴定

1 实验材料

2. 实验方法

2.1 大肠杆菌感受态的制备及转化

2.2 碱裂解法提取质粒

2.3 质粒DNA 测序

2.4 Gene Clean 法回收目的cDNA 片段

2.5 农杆菌感受态的制备及转化

2.6 植物基因组DNA 的提取

2.7 Southern 杂交分析

2.7.1 杂交膜的制备

2.7.2 探针的制备

2.7.3 杂交过程

2.8 异硫氰酸胍法提取植物的总RNA

2.9 Northern 杂交分析

2.9.1 在含有甲醛的凝胶上进行RNA 电泳

2.9.2 RNA 杂交膜的制备

2.9.3 杂交过程

2.10 液泡膜H~+ -ATPase、H~+ -PPase 水解活性的测定

2.10.1 液泡膜微囊的制备

2.10.2 蛋白质含量的测定

2.10.3.V -ATPase 和V-PPase 水解活性的测定

2.11. Western blot 分析

2.12 SsVP 植物表达载体的构建及农杆菌的转化

2.12.1 SsVP 植物表达载体的构建

2.12.2 农杆菌的转化

2.13 拟南芥的培养及转化

2.13.1 植物的生长

2.13.2 菌液的准备

2.13.3 渗透转化

2.13.4 转化子的筛选

2.14 转基因植株的检测

2.14.1 转化子的遗传分析

2.14.2 转基因植株的PCR 检测

2.14.3 转基因植株的Northern 杂交鉴定

3. 实验结果与分析

3.1 盐地碱蓬SsVP cDNA 克隆的分离和鉴定

3.2 SsVP 的基因组Southern 杂交分析

3.3 SsVP 基因在盐和干旱处理下的特异性表达

3.4 SsVP 基因在拟南芥中的过量表达

3.4.1 植物表达载体的构建

3.4.2 转SsVP 基因拟南芥的筛选

3.4.3 NaCl 和干旱胁迫对转SsVP 基因拟南芥V-ATPase、V-PPase 活性的影响

3.4.4 过量表达SsVP 明显提高了转基因拟南芥植株的耐盐性

3.4.5 过量表达SsVP 提高了转基因拟南芥植株的干旱抗性

4. 讨论

第三章盐地碱蓬SsNHX1 基因导入杨树的研究

1 实验材料

2 实验方法

2.1 基本分子生物学实验技术

2.1.1 改良CTAB 法微量提取杨树DNA

2.1.2 Trizol 法提取RNA

2.1.3 转基因杨树的分子检测

2.1.4 转基因杨树的PCR 检测

2.1.5 转基因杨树的RT-PCR 检测

2.1.6 SsNHX1 基因的获得

2.1.7 植物表达载体pROKII-SsNHX1 的构建

2.1.8 植物表达载体的农杆菌转化

2.1.9 菌种的保存

2.2 建立杨树的遗传转化体系

2.2.1 外植体冲洗与消毒

2.2.2 预培养

2.2.3 农杆菌转化方法

2.3 转基因杨树的处理

2.4 对照与转基因杨树叶片干重、鲜重的测定

2.5 对照与转基因杨树Na~+、K~+离子含量的测定

2.6 对照与转基因杨树MDA 含量的测定

2.7 对照与转基因杨树光合水平的测定

2.8 对照与转基因杨树脯氨酸含量的测定

2.9 细胞膜透性的测定

3. 实验结果与分析

3.1 杨树的遗传转化及转基因杨树的分子检测

3.1.1 杨树转化

3.1.2 转基因杨树的RT-PCR 检测

3.1.3 转基因杨树的Northern 杂交

3.2 转基因杨树的耐盐性分析

3.2.1 NaCl 对转SsNHX1 基因杨树生长的影响

3.2.2 盐处理对转基因杨树与野生型杨树相对含水量的影响

3.2.3 转基因杨树与野生型植株中Na~+、K~+ 含量及K~+/Na~+ 比的变化情况

3.2.4 盐处理对转基因杨树与野生型杨树叶片光合的影响

3.2.5 盐处理对转基因杨树与野生型杨树中丙二醛(MDA)的影响

3.2.6 NaCl 处理对转基因杨树细胞膜透性的影响

3.2.7 转基因杨树与野生型对照组织中脯氨酸含量的变化

4 讨论

参考文献

附录

缩写词

攻读博士学位期间的学术论文、获奖成果、著作及参与的科研课题

致谢

图版

发布时间: 2006-01-11

参考文献

[1].小麦耐盐基因的克隆与功能研究[D]. 王莉.河北师范大学2010
[2].大豆耐盐基因定位及耐盐基因GmSKC1的克隆和功能研究[D]. 陈华涛.南京农业大学2009
[3].mtlD/gutD双价耐盐基因转化杨树、猕猴桃的研究[D]. 樊军锋.西北农林科技大学2002
[4].海马齿盐适应细胞形态、结构、蛋白变化及耐盐基因功能初步研究[D]. 段瑞军.海南大学2010
[5].棉花耐盐基因筛选及酪氨酸蛋白磷酸酶基因功能研究[D]. 穆春.中国农业大学2016

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