大黄素抑制血管平滑肌细胞增殖机制研究

论文题目: 大黄素抑制血管平滑肌细胞增殖机制研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 内科学

作者: 王翔飞

导师: 葛均波

关键词: 大黄素,血管平滑肌细胞,凋亡,活性氧,氧化酶,损伤,细胞色素酶,分布,细胞老化,细胞自噬,甲囋

文献来源: 复旦大学

发表年度: 2005

论文摘要: 第一部分大黄素抑制血管平滑肌细胞增殖机制研究背景：大黄素(1，3，8-三羟基-6-甲基葸醌)是天然蒽醌化合物，可以抑制多种肿瘤细胞增生。然而，大黄素对平滑肌细胞的作用机制研究甚少。大黄素能够促进肿瘤细胞(Mahlavu，HL-60)凋亡，Mahlavu细胞凋亡现象可被抗氧化剂(过氧化氢酶和环孢霉素A)部分阻断，但是HL-60细胞凋亡现象不能被抗氧化剂所阻断，因此ROS途径是否参与大黄素诱导细胞凋亡存在争议。大黄素在细菌中常有致突变效应(mutagenicity)，在细胞中常有基因毒性(genotoxicity)。DNA损伤促进p53表达，p53途径活化后既可以抑制细胞生长，又可促进细胞凋亡。ROS途径和p53途径是大黄素发挥作用的可能途径。大黄素可被细胞色素P450代谢酶(CYP)代谢转化为2-羟基大黄素，它抑制增殖效果强于大黄素。CYP抑制剂或者诱导剂可能改变大黄素作用特点。方法：人血管平滑肌细胞(VSMCs)培养于M1 99培养液中。通过细胞计数、MTT法、细胞周期、细胞迁移等方法观察大黄素的作用特点。使用Annexin V和7-AAD双染法、乳酸脱氢酶释放来观察大黄素促VSMCs死亡的方式。对于ROS途径，利用ROS生成阻断剂观察大黄素促ROS生成途径，并观察ROS强度降低后VSMCs死亡方式的变化。对于p53途径，采用p53蛋白印迹、透射电子显微镜、激光共聚焦显微镜进行观察。使用CYP阻断剂和诱导剂观察大黄素作用特点(抑制VSMCs增殖、促进ROS)是否发生变化。利用基因芯片观察上述信号通路基因转录水平的变化。结果：(1)低浓度大黄素(3-1、6.3μg／ml)抑制VSMCs增殖，高浓度大黄素(25.0μg／ml)促进VSMCs死亡。GOG1期细胞呈大黄素浓度依赖性增多，而S期细胞则显著减少，25μg／ml大黄素组S期细胞较正常对照组减少达80％(7.40±1.65％vs．39.05±5.88％，p＜0.05)。不同浓度大黄素均可抑制VSMCs迁移，25μg／ml抑制率为89.6％(p＜0.05)。(2)大黄素以持续稳定的方式促进细胞内ROS生成(r=0.97，p＜0.01)，NADPH氧化酶抑制剂(DPI或PDTC)可以抑制大黄素促ROS效应，而其他抑制剂(CsA、ABT、α-NF)则无抑制效果。细胞内抗氧化能力并无明显变化。大黄素促使VSMCs凋亡和坏死，以凋亡为主。DPI可以显著阻断200μM过氧化氢诱导的VSMCs坏死和凋亡(凋亡：12.6±0.98％vs．4.0±1.00％，p＜0.05，坏死：32.2±2.99％vs．4.87±2.22％，p＜0.05)，也能显著阻断大黄素促VSMCs凋亡(14.55±2.29％vs．8.77±0.83％，p＜0.05)，对坏死并无明显影响(1.18±0.14％vs．1.25±0.28％。p＞0.05)。乳酸脱氢酶活性测定显示大黄素促进VSMCs坏死，可被DPI轻微减轻。(3)大黄素干预后细胞出现非计划性DNA合成(DNA损伤修复标志)。DNA修复基因表达增强。p53蛋白表达也上调(25μg／ml大黄素组较对照组高1.69倍，p＜0.05)。透射电子显微镜显示细胞核中异染色质增多。DPI未影响大黄素的UDS现象。(4)激光共聚焦显示大黄素能迅速渗透进入细胞内部，但在细胞内的分布呈明显的选择性：绝大多数大黄素分布于细胞浆中，仅有少量分布于细胞核内。(5)CYP抑制剂(ABT、α-NF)或者诱导剂(3-MC、β-NF)对大黄素抑制VSMCs增殖和促ROS生成效应均无明显影响。(6)大黄素呈浓度和时间依赖性促进VSMCs老化。我们还观察到大黄素干预后VSMCs自噬的现象。结论：(1)低浓度大黄素抑制VSMCs增殖，高浓度促进VSMCs死亡。(2)ROS途径和p53途径是大黄素发挥效应的两个主要途径，ROS是大黄素促细胞凋亡效应的主要参与者，p53途径主要参与抑制细胞增殖，也涉及细胞凋亡。(3)培养的平滑肌细胞中没有CYP表达，大黄素自身发挥作用，而非代谢产物。第二部分MTT法用于测定大黄素细胞毒性作用的效果背景：MTT法被广泛用于测定药物的细胞毒性作用，但其特异性和敏感性也可以受一些因素的影响，如有颜色物质。我们将探索大黄素自身是否也是干扰因素。方法：血管平滑肌细胞培养于M199培养液中。使用分光光度计测定大黄素和甲(?)的吸光度(O．D．)。结果：在不同溶剂中，大黄素具有不同的吸收光谱。溶剂中存在水分时吸收光谱将向右移，与甲(?)的吸收光谱明显重叠。大黄素呈浓度依赖性直接将MTT还原为甲(?)，大黄素的还原能力可被血清显著抑制。大黄素在细胞内含量非常微弱且其代谢转化非常缓慢。结论：大黄素可以干扰MTT法的准确性，改良后的MTT法可用于评价大黄素的细胞毒性。

论文目录:

摘要

Abstract

前言

第一部分 大黄素抑制血管平滑肌细胞增殖机制研究

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 MTT法测定大黄素细胞毒性作用的效果

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述:大黄素的基因毒性和基因突变性能

综述:大黄素抑制细胞增殖、促进细胞死亡机理

致谢

发布时间: 2007-06-28

参考文献

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