探讨酵母Tra1基因突变对细胞生长及基因表达的影响

论文摘要

真核生物细胞生长与外界环境中营养物质及生长因子的变化紧密相关，细胞整个代谢调控是一个高度复杂和协同进行的过程，而基因的表达调控是整个过程中最基本的层面。核糖体作为合成蛋白的工厂，需要RNA聚合酶Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ共同协调转录，其中核糖体RNA基因的转录调控机制一直是细胞生长和细胞周期调控研究的热点。Tral蛋白是酵母细胞中SAGA及NuA4染色质重塑复合体共有的成分蛋白，对这两个染色质重塑复合体在酵母细胞中的作用及功能的研究较为透彻。研究表明Tral蛋白可能通过NuA4复合体参与了核糖体蛋白基因、核糖体RNA的转录；通过SAGA复合体参与了压力诱导型基因的表达。本课题是利用实验室已经构建的Tral 3355突变、Tral 3285+3375双突变酵母菌株，观察在不同生长环境下它们的生长情况；并通过抽提RNA，利用Northern blot分析不同目标基因（His3、His4、RPS7A、Act1、Scr1）的表达情况，发现Tra1 3355突变、Tra1 3285+3375突变酵母菌株中核糖体RNA、His3、His4、Act1的转录受到影响；意外地发现在Tra1突变的背景下有小RNA积累。这些结果的积累将为下一步基因芯片分析Tra1突变对全基因组表达的影响提供了重要的信息。同时也在SAGA及NuA4复合体中的几个成分蛋白上加上蛋白标签（HA3、Myc13）方便通过免疫共沉淀，Western检测Tra1突变蛋白对SAGA、NuA4复合体完整性的影响。这些实验结果将有助于更深入地了解Tra1在真核细胞核糖体生物合成和细胞生长调节中所起的作用。

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ABSTRACT

第1章引言

1.1 细胞的调控体系

1.2 SAGA复合体和NuA4复合体

1.3 核糖体生物合成

1.3.1 核糖体蛋白的协同表达

1.3.2 核糖体RNA（rRNA）的转录调控

1.4 Tra1蛋白在压力诱导型基因表达和核糖体生物合成过程中的作用

1.5 研究目标及意义

第2章材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 质粒、菌种及引物序列

2.1.2 酶及化学试剂

2.1.3 主要仪器设备

2.1.4 培养基

2.2 实验方法

2.2.1 提取酵母基因组DNA

2.2.2 引物设计与PCR扩增

2.2.3 DNA产物纯化

2.2.4 酶切体系（TaKaRa）

2.2.5 酶连体系（TaKaRa）

2.2.6 DH5a感受态细胞的制备与转化

2.2.7 质粒DNA的提取

2.2.8 酵母转化

2.2.9 酵母菌落PCR

2.2.10 酵母生长曲线的测定

2.2.11 酵母总RNA的抽提（热酚法）

2.2.12 RNA变性电泳

2.2.13 Northern analysis

第3章实验结果

3.1 测定酵母菌生长曲线

3.1.1 酵母菌在SC-Leu培养基的生长曲线

3.1.2 酵母菌在SC-Leu-Ile-Val+0.5μg/ml SM培养基的生长曲线

3.2 利用Northern blot方法检测Tra1突变对酵母基因表达的影响

3.2.1 酵母细胞总RNA的抽提

3.2.2 利用Northern blot检测Tra1突变对His3、His4、RPS7A、Act1、Scr1基因表达的影响

3.3 利用同源重组技术为SAGA和NuA4复合体成分蛋白加标签

讨论

致谢

参考文献

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