可诱导氮芥类DNA交联剂和苯丁酸氮芥萘酰亚胺类化合物的研究

论文摘要

DNA是生命体中遗传信息的主要来源,在新陈代谢中起着十分重要的作用。DNA和许多疾病有着密切的联系,许多癌症就来源于DNA的变异。因此,以DNA为目标分子,用外力来影响DNA的性质或结构,使其不能发挥正常复制转录功能,从而导致细胞死亡的作用方式正成为抗癌药物设计的热门课题。另外,研究药物分子在细胞中的代谢情况一直是科学家们关注的焦点,利用各种方法来观察目标分子在细胞内的活动状况,已在医药、生物材料等领域,特别是化学生物学领域受到越来越多的关注。本文的一个方向是以DNA为靶目标,设计和合成了两种新型可诱导氮芥类DNA交联剂,通过氟离子诱导的方式研究它们与DNA的交联活性以及在肿瘤细胞中的细胞毒性。首先我们利用碱性琼脂糖凝胶电泳实验来检测化合物和质粒pBR322DNA的交联情况,在氟离子诱导的情况下,化合物1和2表现出良好的DNA交联能力,特别是化合物2,相比DNA交联剂苯丁酸氮芥,化合物2在浓度为50μM时交联产率已经达到100%,而苯丁酸氮芥在浓度为500gM时交联产率才达到100%；在碱性琼脂糖凝胶电泳和20%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中,化合物2交联能力约是化合物1的两倍；我们还进一步研究了化合物2在HeLa宫颈癌细胞中细胞毒性,其IC50值为1.7μM；最后我利用高效液相色谱实验来初步验证氟离子诱导化合物释放双（二氯乙基）甲胺的机理。在另一部分工作中我们合成出苯丁酸氮芥萘酰业胺化合物,用荧光滴定法来研究巯基氨基酸和非巯基氨基酸对化合物荧光值的影响；利用高效液相色谱实验来验证巯基氨基酸导致化合物荧光信号变化机理；并用MTT法对化合物的细胞毒性进行了研究,测出其ICso值为28.79μM；我们还通过一系列生物检测,例如碱性琼脂糖凝胶电泳实验、单细胞凝胶电泳实验和γ-H2AX免疫荧光实验,来验证苯丁酸氮芥萘酰亚胺化合物的细胞毒性主要来源于化合物对细胞内DNA造成的损伤。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 DNA简介
• 1.1.1 DNA构成和结构
• 1.1.2 DNA复制在化学生物学中的意义
• 1.2 以DNA为靶目标的抗癌小分子研究
• 1.2.1 癌症
• 1.2.2 癌症的治疗
• 1.2.3 以DNA为靶目标的抗癌药物的治疗
• 1.2.4 DNA烷化剂和交联剂
• 1.2.5 DNA交联剂与DNA作用方式
• 1.2.6 DNA交联剂研究
• 1.2.6.1 顺铂类化合物研究
• 1.2.6.2 氮芥类化合物研究
• 1.2.6.3 吡咯坏并苯二氮化合物研究
• 1.2.6.4 丝裂霉素C研究
• 1.2.6.5 补骨脂素类化合物研究
• 1.2.6.6 苯酚类化合物研究
• 1.2.6.7 含双氮吖丙啶结构化合物研究
• 1.2.6.8 含呋喃核苷修饰物研究
• 1.2.7 具有荧光响应功能药物分子研究
• 1.3 本章小结
• 参考文献
• 第二章 课题设计
• 2.1 可诱导氮芥类DNA交联剂的设计
• 2.2 苯丁酸氮芥萘酰亚胺化合物的设计
• 参考文献
• 第三章 氟离子诱导DNA交联剂的合成及其生物活性检测
• 3.1 合成部分
• 3.1.1 仪器
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 实验部分
• 3.1.3.1 2,5-二叔丁基二甲基硅醚-N,N’-四（2-氯乙基）-N,N’二甲基苄胺的合成
• 3.1.3.2 4-叔丁基二甲基硅醚-N-二(2-氯乙基-N-甲基苄胺的合成
• 3.1.3.3 合成讨论
• 3.2 生物活性检测
• 3.2.1 仪器
• 3.2.2 试剂
• 3.2.3 细胞材料
• 3.2.4 细胞培养
• 3.2.5 MTT细胞毒性实验所用试剂的配制
• 3.2.6 实验原理、方法及步骤
• 3.2.6.1 碱性琼脂糖凝胶电泳的原理
• 3.2.6.2 聚丙烯酰氨凝胶电泳的原理
• 3.2.6.3 碱性琼脂糖凝胶电泳方法和步骤
• 3.2.6.4 短链DNA母液的配置
• 3.2.6.5 20%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法和步骤
• 3.2.6.6 MTT法细胞毒性的原理和步骤
• 3.2.6.7 细胞培养步骤
• 3.2.7 实验结果及讨论
• 3.2.7.1 氟离子浓度对反应体系的影响
• 3.2.7.2 不同阴离子对反应体系的影响
• 3.2.7.3 不同化合物浓度对DNA交联产率的影响
• 3.2.7.4 氟离子诱导化合物与短链DNA交联的能力
• 3.2.7.5 氟离子诱导化合物与短链DNA交联位点的研究
• 3.2.7.6 高效液相色谱分析化合物1经氟离子诱导后产物
• 3.2.7.7 化合物1与DNA交联机理推测
• 3.2.7.8 MTT法细胞毒性实验
• 3.3 本章小结
• 参考文献
• 第四章 苯丁酸氮芥萘酰亚胺化合物的合成及其生物活性检测
• 4.1 合成部分
• 4.1.1 仪器
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 实验部分
• 4.1.4 合成讨论
• 4.2 生物活性检测
• 4.2.1 仪器
• 4.2.2 试剂和材料
• 4.2.2.1 细胞培养液中使用试剂的配制
• 4.2.2.2 MTT细胞毒性实验所用试剂的配制
• 4.2.2.3 单细胞凝胶电泳实验所用试剂的配制
• 4.2.2.4 γ-H2AX免疫荧光法实验所用试剂的配制
• 4.2.2.5 细胞培养步骤
• 4.2.2.6 MTT法细胞毒性的原理和步骤
• 4.2.2.7 单细胞凝胶电泳的原理和步骤
• 4.2.2.8 γ-H2AX免疫荧光法的原理和步骤
• 4.2.3 实验结果及讨论
• 4.2.3.1 DTT诱导NCC化合物紫外滴定实验
• 4.2.3.2 DTT诱导NCC化合物荧光滴定实验
• 4.2.3.3 DTT诱导NCC化合物可视化实验
• 4.2.3.4 pH值对DTT诱导NCC化合物影响
• 4.2.3.5 其他氨基酸和金属离子诱导NCC化合物荧光滴定实验
• 4.2.3.6 DTT诱导NCC化合物时间梯度实验
• 4.2.3.7 高效液相色谱分析NCC化合物经DTT诱导后产物
• 4.2.3.8 碱性琼脂糖凝胶电泳分析NCC化合物经DTT诱导后与DNA交联能力
• 4.2.3.9 在细胞中检测NCC化合物荧光变化
• 4.2.3.10 单细胞凝胶电泳法研究NCC化合物对细胞内DNA的损伤
• 4.2.3.11 γ-H2AX免疫荧光法研究NCC化合物对细胞内DNA的损伤
• 4.2.3.12 MTT法细胞毒性实验
• 4.2.3.13 含巯基氨基酸作用NCC化合物机理推测
• 4.3 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 发表论文
• 致谢
• 附录：化合物表征图谱