论文摘要
研究背景：作为性激素依赖性的肿瘤,乳腺癌的发病率和死亡率均居女性恶性肿瘤的首位,一直以来都是肿瘤研究者关注的重点。相对于雌激素受体（estrogen receptor,ER）和孕激素受体（progesterone receptor,PR）,雄激素受体（androgen receptor, AR）在乳腺癌生物学中的作用是临床和基础研究中被忽略的领域。近年来国外越来越多的实验研究表明AR与乳腺癌的发生、发展和预后密切相关。国内外的许多文献报告结果显示,AR高表达于乳腺癌,在ER阴性的病例有大约1/2的病例AR是阳性的,而且AR阳性乳腺癌患者的临床过程和预后较好。因此搞清AR在乳腺癌中的作用机制,对进一步认识乳腺癌的生物学行为及发展新的治疗方法有着重要意义。已有的研究表明AR通过与雄激素反应元件结合而活化,从而调节靶基因的转录,影响细胞内的基因表达程序,包括微小RNA（micro-ribonucleic acid, microRNA, miRNA）的改变,而近年来非编码的具有重要调控作用的miRNA正是肿瘤研究领域的热点,由于miRNA的改变可以负调控其靶蛋白的表达,因此其既可作为抑癌基因,下调原癌基因的活性；也可作为癌基因,下调抑癌基因的活性。我们的前期研究结果显示,雄激素二氢睾酮（dihydrotestosterone, DHT）可以抑制ER-AR+MDA-MB-453乳腺癌细胞增殖,使细胞周期阻滞在G1-S期,提高AR蛋白的表达,miRNA芯片杂交结果筛选出明显上调和下调的miRNA。本研究在前期研究的基础上,从筛选出的miRNA中找到有意义的2个miRNA进行了深入研究并取得了一些重要发现。研究目的：1.明确let-7a与AR活化之间的相关性,并对let-7a进行细胞功能学研究,阐明AR活化、let-7a及其靶蛋白在DHT抑制ER-AR+乳腺癌细胞增殖中的重要作用。2.明确miR-30a与AR活化之间的相关性,对miR-30a进行细胞功能学研究,证实其靶蛋白是否为通过生物信息学方法发现的AR,阐明AR和miR-30a之间的关系及其在DHT抑制ER-AR+乳腺癌细胞增殖中的重要作用。研究方法：1.分析miRNA芯片杂交结果,生物信息学技术预测靶基因为AR的可能miRNA。2.采用实时定量RT-PCR方法,验证miRNA芯片杂交筛选出的明显上调的miRNAlet-7a和明显下调的miR-30a,b,c。3.染色质免疫沉淀技术证实AR活化与let-7a和miR-30a启动子的相互作用。4.通过Western blot技术检测乳腺癌细胞中AR、c-Myc和k-Ras蛋白的表达。5.通过构建质粒和细胞转染实验使细胞中的miRNA上调。6.通过转染miRNA特异性反义寡核苷酸（specific antisense oligonucleotide,ASO）使细胞中的miRNA下调。7.MTT和流式细胞术方法检测细胞增殖和细胞周期的变化。8.应用双荧光蛋白报告基因分析系统证实AR为niR-30a的靶基因。研究结果：1.对miRNA芯片杂交筛选出的miRNA结果进行分析发现上调大于1.5倍,的miRNA有43个,其中包括let-7a,b,c,d,e,g六个,进一步分析发现只有其中的let-7a,b,c,d为上调大于2倍,且信号值大于1000的miRNA;下调大于1.5倍的miRNA有51个,其中包括miR-30a,b,C。2.生物信息学预测软件预测靶基因为AR的可能的且在miRNA芯片杂交筛选出的有意义的miRNA为niR-30a,b,c。3.对let-7a及miR-30a,b,c进行实时定量RT-PCR,结果显示let-7a的上调倍数近13倍,miR-30a下调5倍,miR-30b下调大于2倍,miR-30c下调接近2倍,选择上调的let-7a及下调的miR-30a进一步研究。4.染色质免疫沉淀证实了AR活化后可以直接上调let-7a,但不直接调节miR-30a。5.DHT刺激MDA-MB-453细胞后,c-Myc和k-Ras表达下调,AR表达上调。6.实时定量RT-PCR证实细胞转染成功,与对照组相比,在转染过表达质粒组let-7a和miR-30表达上调,转染ASO组let-7a和miR-30表达下调7. MDA-MB-453细胞转染后,在let-7a低表达组,细胞增殖活性增高；细胞周期中S期细胞比例增加,G1期细胞比例减少;let-7a的已知靶蛋白c-Myc和k-Ras表达上调。在let-7a高表达组,则出现相反的结果。8. MDA-MB-453细胞转染后,在miR-30a低表达组,细胞增殖活性增高；细胞周期中S期细胞比例增加,G1期细胞比例减少,预测的靶蛋白AR表达上调。在miR-30a高表达组,则出现相反的结果。9.双荧光蛋白报告基因分析系统证实了AR为：miR-30a的靶基因。结论：1.作为转录因子AR活化可以作用于let-7a的启动子直接上调let-7a。2.AR是miR-30a的靶蛋白,受miR-30a的直接调控。3.let-7a和：miR-30a均为抑癌miRNA。4.雄激素诱导的AR活化直接上调let-7a, let-7a又下调其靶蛋白c-Myc和k-Ras,这一信号通路雄激素抑制ER-AR+乳腺癌细胞生长过程中发挥重要作用。5. miR-30a为抑癌miRNA,而雄激素诱导的AR活化可以下调miR-30a,但对miR-30a没有直接调控作用,miR-30a在雄激素抑制ER-AR+乳腺癌细胞生长过程中的作用可能主要是通过上调其靶蛋白AR实现的。