华南地区猪群中葡萄球菌的分离鉴定及猪葡萄球菌EXHC毒素基因的原核表达

论文摘要

猪渗出性皮炎是由葡萄球菌引起的一种以哺乳仔猪和刚断奶仔猪的急性或超急性接触性传染病,患病仔猪主要以渗出性,发热、脱水和死亡为主要临床特征,具有传播快、死亡率高等特点。该病严重影响仔猪的生长发育,给我国养殖业造成了较大的经济损失。本研究针对华南周边地区疑似患有渗出性皮炎的病猪进行了葡萄球菌的分离鉴定及分类;通过对筛选出的7株猪葡萄球菌脱落毒素基因的检测建立了脱落毒素基因的PCR检测方法;对鉴定出的EXHC基因进行了克隆和表达。1、通过镜检、生化鉴定初步分离到了16株葡萄球菌;动物致病性试验中,猪葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、松鼠源葡萄球菌、产色葡萄球菌的试验组小鼠的死亡率分别为:100%,83.3%,66.7%,100%,16.7%,而模仿葡萄球菌、科氏葡萄球菌的实验组有没有死亡个体;药敏试验中这些菌株对头孢类、新生霉素等抗生素高度敏感,对青霉素类抗生素产生耐药性。2、参照葡萄球菌Gap （ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases,甘油醛-三磷酸脱氢酶）和16S rRNA基因的通用引物对初步鉴定出的16株葡萄球菌进行了基因克隆和序列分析。Gap基因克隆测序结果在NCBI上进行Blast分析,分离的16株菌株可以归类为Staphylococcus hyicus、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus chromogenes、Staphylococcus simulans、Staphylococcus sciuri、Staphylococcus cohnii、Staphylococcus haemolyticus,其同源性分别为100%、99%、93%、100%、98%、96%、99%,以上分离到的7类菌种与不同亚种之间的同源性75.6～99%。16S rRNA基因克隆、序列比对分析显示葡萄球菌属的不同亚种之间核苷酸差异性不明显,同源性为92%以上。3、利用建立的PCR检测方法对分离的7株猪葡萄球菌进行脱落毒素基因的检测。结果显示SHETA的检出率为100%;EXHA的检出率为28.7%;EXHC、EXHB的检出率均为14.3%。4、对分离的GDZC株进行了Gap基因的克隆及序列分析,并对EXHC基因进行了克隆和表达。结果表明,该菌株Gap基因与Genbank已发表猪葡萄球菌（AF495492）菌株的核苷酸同源性为99%;EXHC基因与Genbank上已发表的丹麦分离株（AF515455）核苷酸序列同源性为100%。将EXHC基因插入pET-28a （+）载体,经酶切和测序鉴定正确后,成功构建了pET-28a （+）-EXHC原核表达载体。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 国内外研究的概况
• 1.2 病原学
• 1.3 流行病学
• 1.4 生物学特性及脱落毒素
• 1.4.1 生物学特性
• 1.4.2 脱落毒素
• 1.5 临床症状
• 1.6 诊断方法
• 1.6.1 细菌学方法
• 1.6.2 分子生物学方法
• 1.6.3 血清学诊断
• 1.7 治疗与预防
• 1.7.1 治疗
• 1.7.2 预防
• 1.8 研究目的及意义
• 2 葡萄球菌的初步分离鉴定及药敏试验
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 培养基及试剂
• 2.1.1.2 实验动物
• 2.1.1.3 主要仪器
• 2.1.1.4 培养基的配制
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 病料采集
• 2.1.2.2 细菌的分离
• 2.1.2.3 革兰氏染色镜检
• 2.1.2.4 生化鉴定
• 2.1.2.5 动物致病性试验
• 2.1.2.6 药敏试验
• 2.1.2.7 分离菌株的菌种保存
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 临床症状
• 2.2.2 细菌分离
• 2.2.3 生化鉴定
• 2.2.4 动物试验
• 2.2.5 药敏试验
• 2.3 讨论
• 3 猪群中葡萄球菌 Gap 基因、16S rRNA 基因的克隆及系统进化分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 菌种与载体
• 3.1.1.2 试剂
• 3.1.1.3 主要仪器设备
• 3.1.1.4 主要溶液配方
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 引物
• 3.1.2.2 基因组DNA 的抽提
• 3.1.2.3 PCR 扩增
• 3.1.2.4 凝胶电泳
• 3.1.2.5 PCR 扩增产物的回收
• 3.1.2.6 目的片段与载体的连接
• 3.1.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 3.1.2.8 连接产物的转化
• 3.1.2.9 Gap 基因、16srRNA 基因核苷酸序列测定及遗传进化分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 Gap 基因的 PCR 扩增结果
• 3.2.2 16S rRNA 基因的 PCR 扩增结果
• 3.2.3 Gap 基因核苷酸序列遗传进化分析
• 3.3 讨论
• 4 猪葡萄球菌毒素基因检测方法的建立
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 菌种与载体
• 4.1.1.2 试剂
• 4.1.2.3 主要仪器设备
• 4.1.2.4 主要溶液配方
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 引物
• 4.1.2.2 基因组DNA 的抽提
• 4.1.2.3 PCR 扩增
• 4.1.2.4 凝胶电泳
• 4.1.2.5 连接产物的转化
• 4.2 结果与分析
• 4.3 讨论
• 5 GDZC 株猪葡萄球菌EXHC 毒素基因原核表达载体的构建
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.1.1 菌株及质粒
• 5.1.1.2 主要试剂
• 5.1.1.3 所需主要试剂的配制
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 引物设计
• 5.1.2.2 基因组DNA 的抽提
• 5.1.2.3 GDZC 菌株的 EXHC 脱落毒素基因的PCR 扩增
• 5.1.2.4 GDZC 菌株的 EXHC 基因的克隆及序列分析
• 5.1.2.5 GDZC 菌株的 EXHC 毒素基因重组表达载体的构建
• 5.1.2.6 GDZC 菌株的 EXHC 毒素基因的诱导表达
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 GDZC 株 Gap 基因的 PCR 扩增结果
• 5.2.2 EXHC 毒素基因的 PCR 扩增结果
• 5.2.3 GDZC 菌株的 Gap 基因及 EXHC 毒素基因的序列分析结果
• 5.2.4 GDZC 菌株 EXHC 毒素基因重组表达载体的构建
• 5.2.4 GDZC 菌株 EXHC 毒素基因的诱导表达
• 5.3 讨论
• 6 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介