泥蚶血红蛋白克隆、表达与免疫相关性研究

论文摘要

泥蚶（Tegillarca granosa）俗称血蚶、花蚶、粒蚶等，隶属于瓣鳃纲列齿目，蚶科，蚶属。是我国传统养殖贝类之一广泛分布于山东、浙江、福建、广东等地，浙江是国内泥蚶养殖面积和产量最大的省份。然而近年来养殖泥蚶病害死亡频发，深入开展泥蚶功能基因的研究，尤其是免疫相关基因及其机制研究并在此基础上寻找泥蚶疾病防治的有效方法对泥蚶的健康养殖十分重要。对于贝类免疫系统来说，其血细胞在先天性免疫防御中起着重要的作用。周永灿和潘金培认为在贝类中参与免疫的主效因子是血细胞，由于贝类不具有特异性免疫，只有细胞和体液的非特异性免疫系统，因此，血细胞对贝类免疫来说至关重要，它是贝类体内抵御外来病原生物侵袭的主要“屏障”。刘世良等发现贝类血细胞的功能与维持体内各种生理环境的稳定性有密切关系，血细胞除具有营养、防御的功能，主要通过参与包埋，吞噬，结节形成，细胞凝块和伤口修复等过程起到免疫防御作用。这表明泥蚶、毛蚶等蚶科动物血红细胞与脊椎动物血液内的免疫细胞具有相似的功能，承担了部分免疫功能。在分子水平方面，Jiang等研究发现人血红蛋白具有潜在类酚氧化酶活性，能有效杀灭金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和铜绿假单胞菌（Pseudo monas aeruginosa）等细菌；Nedjar-Arroume等发现牛血红蛋白水解片段对藤黄微球菌A270（MicrococcusluteusA270）等具有抑制作用，说明哺乳动物血红蛋白具有一定的抗菌免疫作用。鲎（Limulus polyphemus）、龙虾（Pacifastacus leniusculus）、章鱼（Octopus vulgaris）和红皱岩螺（Rapana venosa）等无脊椎动物的血细胞中，血蓝蛋白也具有酚氧化酶或类酚氧化酶活性，可以杀灭细菌。因此研究泥蚶血红蛋白对于泥蚶免疫防御机制的研究有重要的意义。首先，采用Hemacolor染料对泥蚶等5种水产动物血细胞涂片进行染色，利用光镜和扫描电镜两种方法对5种动物的血红细胞的表面结构和形态特征进行观察，以期对血红细胞形态差异及进化规律进行探讨。结果发现：泥蚶、毛蚶两种蚶科贝类血红细胞具有嗜酸性或嗜碱性颗粒，而鲫鱼、牛蛙、中华鳖3种水产脊椎动物则没有；从蚶科贝类到牛蛙，血红细胞直径不断增大，而中华鳖血红细胞直径则变小；血红细胞长宽比也符合这一变化趋势。泥蚶和毛蚶血红细胞表面有明显的波状褶皱和较深的且直径较大的凹陷；3种脊椎动物血红细胞表面也发现了直径较小的凹陷，但未发现皱褶的存在，且表面凹陷程度逐渐减弱。分析认为动物不断进化，其活动能力和生境也在变化，使得动物血红细胞发生相应的变化，以获得最大的气体交换效率与细胞稳定性。其次，本文通过RACE方法获得了泥蚶血红蛋白家族三种基因的cDNA全长并对其进行了序列的生物信息学分析，泥蚶血红蛋白Tg-HBI全长cDNA为748个碱基，其中开放阅读框为441个碱基，编码147个氨基酸，泥蚶与贝类动物毛蚶、不等壳毛蚶HbI氨基酸序列同源性显著，一致度都为82%，但与其他动物一致度较低。Tg-HBIIA全长cDNA为731个碱基，其中开放阅读框为450个碱基，编码150个氨基酸，序列比对结果发现Tg-HBIIA的氨基酸序列与与毛蚶、不等壳毛蚶HbIIA氨基酸序列同源性显著，一致度分别为89%、88%。Tg-HBIIB全长cDNA为698个碱基，其中开放阅读框为456个碱基，编码152个氨基酸。Tg-HBIIB与其他物种血红蛋白HBIIB相似度比较低，与毛蚶、不等壳毛蚶HbIIA氨基酸序列同源性显著性较低，一致度分别为45%；与Barbatia lima同源性较高为57%，泥蚶与其它动物血红蛋白基因同源性较低（<30%）。再次，采用长片段PCR的方法得到了泥蚶三种血红蛋白基因的基因组全长并对其进行了相关分析。Tg-HBI的基因组序列全长为2031bp，Tg-HBIIA的基因组序列全长为1797bp，Tg-HBIIB的基因组序列全长最长为3203bp，它们都具有三外显子，两内含子结构。同时发现泥蚶三种血红蛋白基因组序列中有较多重复序列暗示可能与基因的表达调控，移动元件的逆转录和重组有关，其中内含子中的重复序列可能成为今后基因选择或SNP分析的遗传标记。最后，采用qRT-PCR（quantitative real time PCR）方法分析三种血红蛋白基因在不同组织中的表达情况，结果表明三种血红蛋白基因的组织表达总体一致但稍有差异。三种血红蛋白基因在血液中表达水平最高，其次是鳃和外套膜，在肝胰腺中表达量最低；Tg-HBI在外套膜中表达量较鳃高，而Tg-HBII两种基因（Tg-HBIIA，Tg-HBIIB）在鳃中的表达量较外套膜稍高。同时，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticu）、脂多糖（LPS）、肽聚糖（PGN）感染后泥蚶血细胞中三种血红蛋白基因mRNA表达变化进行了检测。副溶血弧菌、LPS、PGN刺激后泥蚶血液中三种血红蛋白的mRNA在48h内的变化有所不同。泥蚶血红蛋白三种基因mRNA在弧菌刺激12h内其在血液中的表达量显著上升，这表明泥蚶它们是一种可诱导的快速表达蛋白，它对于菌刺激相当敏感，可能在泥蚶抗菌免疫方面其重要作用。研究发现泥蚶Tg-HbI的表达对于细菌蛋白酶的刺激相当敏感；Tg-HBIIA的偏向于革兰氏阳性细菌引起的免疫刺激；Tg-HBIIB对于革兰氏阴性细菌的刺激更为敏感，具体机制将成为我们血红蛋白研究的另一重点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 血红蛋白结构
• 1.1.1 脊椎动物
• 1.1.2 无脊椎动物
• 1.2 血红蛋白的生物学功能
• 1.2.1 脊椎动物
• 1.2.2 无脊椎动物
• 1.3 血红蛋白基因的研究进展
• 1.3.1 血红蛋白基因的研究
• 1.3.2 基因进化过程
• 1.4 本研究的目的和意义
• 1.4.1 本研究的目的
• 1.4.2 本研究的意义
• 第二章 泥蚶等五种水产动物血红细胞观察与进化分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验主要试剂与仪器
• 2.1.3 主要试剂的配置
• 2.1.4 实验方法
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 泥蚶等五种水产动物血红细胞光学显微镜观察结果
• 2.2.2 泥蚶等五种水产动物血红细胞扫描电镜观察结果
• 2.3 讨论
• 2.3.1 蚶科贝类血红细胞形态分析
• 2.3.2 蚶科贝类与其他3种水产脊椎动物血红细胞比较分析
• 第三章 泥蚶三种血红蛋白基因cDNA克隆和分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 Tg-HBIcDNA序列分析和推导的氨基酸序列
• 3.2.2 Tg-HBIIAcDNA序列分析和推导的氨基酸序列
• 3.2.3 Tg-HBIIBcDNA序列分析和推导的氨基酸序列
• 3.2.4 泥蚶血红蛋白三种基因氨基酸序列的比较分析
• 3.2.5 泥蚶三种血红蛋白与其它软体动物血红蛋白系统进化树分析
• 3.2.6 泥蚶三种血红蛋白的三维结构预测
• 3.3 讨论
• 第四章 泥蚶三种血红蛋白基因组结构研究与分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 Tg-HBI基因组DNA序列分析
• 4.2.2 Tg-HBIIA基因组DNA序列分析
• 4.2.3 Tg-HBIIB基因组DNA序列分析
• 4.2.4 泥蚶血红蛋白基因家族比较分析
• 4.3 讨论
• 第五章 泥蚶三种血红蛋白基因荧光定量PCR分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 泥蚶三种血红蛋白基因组织表达特异性研究
• 5.2.2 泥蚶三种血红蛋白基因免疫刺激研究
• 5.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录：硕士期间发表及参与发表（含第二作者）文章
• 致谢