阿司匹林诱生型脂氧素A4对脂多糖诱导小胶质细胞炎症反应的影响

论文摘要

目的：研究阿司匹林诱生型脂氧素A4（aspirin-triggered lipoxin A4, ATL）对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的小胶质细胞炎症介质的产生及其mRNA的表达的影响,以探讨ATL对小胶质细胞炎症反应的影响及其机制。方法：以100ng/ml的LPS刺激体外培养的BV-2细胞作为炎症模型,根据药物不同将细胞分为5组：（1）对照组：用含0.035%乙醇的无血清培养基处理；（2）ATL组：用含不同浓度ATL （1mM、10nM、100nM）的无血清培养基处理；（3）LPS组：用含0.035%乙醇的无血清培养基处理30min后加终浓度为100ng/ml的LPS处理；（4）ATL+LPS组：用含不同浓度ATL （1nM、10nM、100nM）的无血清培养基处理30min后加终浓度为100ng/ml的LPS处理。（5）Boc-2+ATL+LPS组：在用ATL和LPS处理前加100μMBoc-2处理30min。逆转录PCR检测BV-2细胞脂氧素A4受体（lipoxin A4 receptor, ALX）基因水平的表达；采用MTT法测定各组细胞活力；ELISA法检测细胞培养上清中白介素1β（interleukin-1 beta, IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）的浓度；硝酸还原酶法测定细胞培养上清中一氧化氮（nitric oxide, NO）的浓度；Western blotting检测细胞诱导性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）蛋白表达；real-time PCR检测细胞iNOS、IL-1β和TNF-αmRNA的表达水平。结果：BV-2小胶质细胞在mRNA水平表达ALX（ALX1/FPR-rs1和ALX2/FPR2）,LPS刺激6h可上调其表达P<0.05)。不同浓度的ATL对LPS刺激24h的BV-2细胞活力无显著的影响（P>0.05）。100ng/ml LPS刺激BV-2细胞24h,细胞培养上清中的NO、IL-1β和TNF-a水平均显著升高（P<0.001）。10nM和100nM ATL能够抑制LPS诱导的NO、IL-1β和TNF-a产生（P<0.01）;1nMATL对炎症相关介质的产生无明显影响（P>0.05）。ALX拮抗剂Boc-2能显著阻断ATL的抗炎效应。与对照组相比,100ng/ml LPS刺激BV-2细胞6h,iNOS、IL-1β和TNF-amRNA的表达水平均显著升高（P<0.01）。与LPS组相比,10nM和100nMATL能降低LPS诱发的iNOS、IL-1β和TNF-αmRNA的表达水平上调（P<0.01）。结论：ATL可抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症介质NO、IL-1β和TNF-α的产生。ATL的抗炎作用可能是通过抑制炎症介质的基因表达来实现的。目的：研究ATL对LPS/Toll样受体4（Toll-like receptor 4）诱导的小胶质细胞核因子κB（nuclear factor-kappaB,NF-κB）和丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPKs）信号通路激活的影响,以探讨ATL在小胶质细胞发挥抗炎作用的机制。方法：以100ng/ml的LPS刺激体外培养的BV-2细胞作为炎症模型,根据药物不同将细胞分为4组：（1）对照组：用含0.035%乙醇的无血清培养基处理；（2）ATL组：用含100nMATL的无血清培养基处理；（3）LPS组：用含0.035%乙醇的无血清培养基处理30min后加终浓度为100ng/ml的LPS处理；（4）ATL+LPS组：用100nMATL的无血清培养基处理30min后加终浓度为100ng/ml的LPS处理。激光共聚焦显微镜观察NF-κB p65亚基在细胞内定位的变化；Western blotting检测细胞p65亚基的转位、IκB-α蛋白降解以及MAPKs蛋白磷酸化；电泳迁移率分析（electrophoretic mobility shift assays,EMSA）检测转录因子NF-κB和激活蛋白-1（activator protein-1,AP-1）的DNA结合活性。结果：100ng/ml LPS刺激BV-2细胞可诱导NF-κB p65亚基核转位,作用60min时核转位最显著；免疫荧光和Western blotting结果均显示,100nM ATL预处理可抑制LPS诱导的p65核转位。此外,100nM ATL可抑制LPS诱导的IKB-a蛋白降解。LPS可诱导BV-2细胞的细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase,ERK）1/2、p38、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）磷酸化水平增加,作用30min时磷酸化最显著；100nM ATL可抑制LPS诱导的ERK1/2、p38磷酸化,对JNK磷酸化无显著影响；100nMATL可诱导JNK磷酸化水平增加。EMSA结果显示,100nMATL可抑制LPS诱导转录因子NF-κB和AP-1的DNA结合活性增加。结论：ATL可抑制LPS诱导的小胶质细胞IκB降解、抑制NF-κB核转位以及ERK1/2、p38磷酸化、抑制NF-κB和AP-1的转录活性。因此,ATL发挥抗炎作用可能是通过抑制NF-κB和MAPK/AP-1信号通路实现的。目的：研究ATL对LPS诱导的小胶质细胞活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）产生的影响,探讨ATL在小胶质细胞发挥抗氧化的机制。方法：以100ng/ml的LPS刺激体外培养的BV-2细胞作为炎症模型,根据药物不同将细胞分为4组：（1）对照组：用含0.035%乙醇的无血清培养基处理；（2）ATL组：用含100nMATL的无血清培养基处理；（3）LPS组：用含0.035%乙醇的无血清培养基处理30min后加终浓度为100ng/ml的LPS处理；（4）ATL+LPS组：用100nMATL的无血清培养基处理30min后加终浓度为100ng/ml的LPS处理。采用荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS的水平；激光共聚焦显微镜检测血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）的表达；Western blotting检测细胞HO-1的表达、核因子红系-2p45相关因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2, Nrf2）的表达及其核转位。结果：100ng/ml LPS诱导BV-2细胞ROS水平增高,12h达到峰值；100nM ATL预处理30min可显著减少ROS产生。ATL可时间依赖性、剂量依赖性地上调HO-1蛋白表达,100nM ATL作用24h达到峰值。免疫荧光结果表明,100nM ATL处理细胞24h后,HO-1荧光强度显著增强。Western blotting结果显示,100nM ATL处理细胞可时间依赖性地上调Nrf2蛋白表达；此外,ATL在短时间（120min）内即可诱导Nrf2蛋白核转位并增强LPS诱导的Nrf2核转位。结论：ATL能够抑制LPS诱导的BV-2细胞ROS产生。ATL的抗氧化作用可能是通过增强Nrf2蛋白表达及其核转位、诱导HO-1蛋白表达实现的。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 参考文献
• 4对脂多糖诱导小胶质细胞炎症介质表达的影响'>第一部分 阿司匹林诱生型脂氧素A₄对脂多糖诱导小胶质细胞炎症介质表达的影响
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 4对小胶质细胞脂多糖/Toll样受体4介导的信号通路的影响'>第二部分 阿司匹林诱生型脂氧素A₄对小胶质细胞脂多糖/Toll样受体4介导的信号通路的影响
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 阿司匹林诱生型脂氧素凡对脂多糖诱导小胶质细胞氧化应激的影响
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 致谢