阿特拉津降解菌生物学特性的研究，关键降解酶基因克隆及基因簇的构建

论文摘要

阿特拉津是一种在国内外广泛使用的三嗪类除草剂,在杂草防除方面占有重要地位。阿特拉津虽然是一种低毒除草剂,但是它的残留会对后茬敏感作物如小麦、大豆、水稻等产生药害。因此阿特拉津污染土壤的生物修复已成为农药污染控制领域的研究热点,研究微生物降解有助于形成生物修复的策略。本研究是从农药厂废水处理池的活性污泥中分离到一株阿特拉津降解茵X-4,根据该菌株的形态、生理生化特性和16S rRNA基因序列相似性分析,将其初步鉴定为节杆菌属（Arthrobacte sp.）。菌株X-4在pH 6.0-10.0范围内生长良好,最适生长pH为6.0,最适生长温度为30℃,麦芽糖为其最适生长碳源,牛肉膏为其最适生长氮源。在含有100 mg·L-1的阿特拉津的无碳无氮培养基中,菌株X-4在42 h内对阿特拉津的降解率达95.7%。菌株X-4对阿特拉津的最适降解温度为30℃。在1 mmol·L-1的浓度条件下,菌株X-4除了对Cu2+, Mn2+, Hg2+三种重金属离子敏感外,对其他常见的重金属离子都具有良好的抗性,显示该茵在处理阿特拉津和重金属复合污染方面有一定的应用潜力。根据已报道的阿特拉津降解相关基因设计引物,以菌株X-4的总DNA为模板,扩增出trzN全长基因,与C190菌株的trzN序列相似性为100%,扩增出的atzB, atzC保守片段与已报道的其它菌株相应的序列相似性分别为100%、99%,说明该菌的降解相关基因是trzN与atzBC基因的组合。以本实验室保存的pETatzA和菌株X-4为基础,通过PCR扩增出atzA, atzB和atzC基因全长；将其分别克隆到质粒pUC18上,给每个基因添加表达元件,再通过组合构建了带有atzABC基因簇的重组质粒pUCatzABC,将其转化到大肠杆菌后,菌株能将阿特拉津降解为氰尿酸,完成阿特拉津降解途径中的关键步骤。重组质粒pUCatzABC为构建能够降解阿特拉津的基因工程菌奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与缩略语说明
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 阿特拉津简介
• 2 阿特拉津造成的危害
• 3 环境中阿特拉津残留的标准
• 4 微生物对阿特拉津降解的途径及相关基因
• 4.1 阿特拉津降解途径
• 4.2 阿特拉津相关降解酶及基因
• 5 基因工程菌的构建及应用
• 5.1 基因工程菌的构建思路及关键因素
• 5.2 基因工程菌的应用前景
• 6 本研究的目的和意义
• 第二章 阿特拉津降解菌的分离和生物学特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 培养基和试剂
• 1.2 降解菌株的分离
• 1.3 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定
• 1.4 降解菌株16S rRNA基因序列的扩增及测序
• 1.5 降解菌株系统发育地位的确定
• 1.6 菌体生长量的测定
• 1.7 阿特拉津的含量测定
• 2 结果与讨论
• 2.1 阿特拉津降解菌株的分离
• 2.2 降解菌株X-4的菌落形态及生理生化特征
• 2.3 菌株X-4的16S rRNA基因扩增
• 3 小结
• 第三章 菌株X-4生长特性和降解特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 菌体生长量的测定方法
• 1.4 阿特拉津含量测定
• 1.5 种子液制备
• 2 结果与讨论
• 2.1 温度对菌株X-4生长的影响
• 2.2 初始pH对菌株X-4生长的影响
• 2.3 通气量对菌株X-4生长的影响
• 2.4 NaCl浓度对菌株X-4生长的影响
• 2.5 不同碳源对菌株X-4生长的影响
• 2.6 不同氮源对菌株X-4生长的影响
• 2.7 菌株X-4对抗生素的耐受性
• 2.8 菌株X-4的生长和阿特拉津降解的关系
• 2.9 阿特拉津起始浓度对菌株X-4降解阿特拉津的影响
• 2.10 接种量对菌株X-4降解阿特拉津的影响
• 2.11 不同金属离子对菌株X-4降解阿特拉津的影响
• 2.12 温度对菌株X-4降解阿特拉津的影响
• 3 菌株X-4中阿特拉津降解酶基因的初步扩增
• 4 小结
• 第四章 阿特拉津关键降解酶基因克隆及基因簇的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 培养基与试剂
• 1.2 所用菌株与质粒
• 1.3 PCR产物的纯化及T/A克隆
• 1.4 质粒DNA的提取和感受态细胞的制备
• 1.5 pUCatzABC的构建策略
• 1.6 pUCatzA、pUCatzB、pUCatzC的构建
• 1.7 构建pUCatzAB
• 1.8 构建pUCatzABC
• 1.9 验证pUCatzABC的功能
• 2 结果与讨论
• 2.1 构建pUCatzA、pUCatzB、pUCatzC
• 2.2 构建pUCatzAB
• 2.3 构建pUCatzABC
• 2.4 验证pUCatzABC的功能
• 3 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 附录一 文中所用培养基及试剂配方
• 附录二 相关DNA序列
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文