HBO对新生鼠缺血缺氧性脑损伤的治疗效应及作用机制研究

论文摘要

目的1、判断高压氧（HBO）是否对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠具有治疗作用;2、观察HBO对于缺氧缺血性脑损伤新生大鼠内源性神经干细胞的影响;3、探讨HBO治疗的具体作用机制,为探索治疗新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）的有效方法提供科学的实验依据和新的思路。方法将新生7日龄SD大鼠120只随机分成3组,分别为假手术组（sham）（n=40）、缺氧缺血性模型组（control）（n=40）、HBO治疗组（trial）（n=40）。采用经典的Rice法制成HIBD模型,SD大鼠经乙醚麻醉后仰卧固定于手术台上,颈部常规消毒,做颈部正中切口游离左侧颈总动脉并双线结扎,剪断线结之间的血管,缝合皮下及皮肤。缝合皮肤后,立即置于8%氧浓度、舱温（36±1℃）的自制常压缺氧舱中,持续2小时后出舱。造模过程中密切观察SD大鼠神经系统的异常改变并进行神经功能缺陷评分,将神经功能缺陷评分为1-3分者纳入实验。sham组切开皮肤后,仅分离右侧颈总动脉,不结扎也不进行缺氧及注射药物等处理;control组在造膜成功后,不再做其他处理;trial组在造模成功后即给予高压氧治疗（匀速升压10min,使舱内压力达0.2Mpa后排气,保持舱内压力及氧浓度恒定,稳压20min后关闭进气阀,匀速降压10min至常压出舱,最长治疗时间5天,每天1次,最多治疗5天）。于缺血缺氧后7天、14天和21天各处死10只,灌注固定后,根据大鼠脑立体定位图谱,将固定的鼠脑从前囟后以视交叉为中心,前后2～6mm行冠状面冰冻切片。选取10～20μm的冰冻切片切片进行HE染色,60μm的冰冻切片进行免疫组化染色;分别观察脑组织病理改变,以及脑海马区和脑感觉运动皮层区nestin蛋白的阳性表达情况。剩余的30只大鼠继续喂养,以大鼠37～41日龄的学习记忆功能（morris水迷宫实验）、大鼠42日龄的脑组织形态学改变和大鼠42日龄神经元的机能状态（nissl实验）来判断干预效果。结果1、HE染色:sham组海马各部组织结构正常,可见有3-4层椎体细胞,排列整齐紧密,高倍镜下可见这些神经元核大而园,透明,有1-2个明显的核仁。control组术后7天可见椎体细胞溶解,突起断裂、变短或消失,轮廓模糊,椎体细胞减少,海马CA1区椎体细胞排列散乱,周围胶质细胞增生明显;术后14天及21天相似,表现为椎体细胞排列紊乱、疏松,层次不清,细胞间隙增大,神经元及胶质细胞严重皱缩、深染,核缩小呈梭形及三角形,核仁不清,仅残留部分正常神经元。trial组术后7天可见大量的椎体细胞溶解,突起断裂,变短或消失,轮廓模糊,椎体细胞减少,海马CA1区椎体细胞排列散乱;术后14天及21天相似,表现为椎体细胞排列整齐,细胞胞浆丰富,核仁清楚,但椎体细胞层较假手术组左侧薄。2、nestin蛋白免疫组化染色阳性表达在脑不同部位的检测:两个不同部位的计数均以缺氧缺血后第7天trial组的nestin阳性细胞数目最高,14天后nestin表达开始下降,21天仍有表达。各组的阳性细胞数用平均数±标准差表示,各实验组均数间的比较采用析因设计资料方差分析,α=0.05为显著性检验标准。3组大鼠不同处死时间点大鼠脑海马区Nestin阳性细胞的形态学观察:sham组:nestin阳性表达的神经前体细胞染色偏淡,胞体突起不明显。control组和trial组:阳性表达的神经前体细胞呈明显的区域性分布,胞浆呈棕黄色,染色较深,胞体突起明显,胞核呈空泡状。主要分布在海马区的分子层、椎体细胞层和内颗粒细胞层。不同时间点nestin阳性细胞在分布区域、形态以及生长方式等方面存在一定的差异。3组大鼠不同处死时间点左侧大脑海马区Nestin阳性细胞检出率比较:使用析因设计资料的方差分析,结果显示组间差异有显著性（F=342.677,P＜0.001）,各实验组每一时间点的nestin阳性细胞数目从多到少分别为trial组＞control组＞sham组。不同时间点间差异也有显著性（F=185.654,P＜0.001）,随着时间的延长,nestin阳性细胞数大体呈下降趋势。实验组与时间之间存在交互作用（F=72.167,P＜0.001）,提示各实验组nestin阳性细胞检出率的变化随时间的增加而具有不同的变化趋势。进一步分析单独效应,结果显示各时间点内两组间比较均有显著性差异（P＜0.001）,各实验组每一时间点的nestin阳性细胞数目均为trial组最多,sham组最少。每个实验组的nestin阳性细胞数目在不同时间点间的比较显示,除sham组P=0.006外,其余各组P值均小于0.001。同一组内nestin阳性细胞数目在不同时间点的比较均为7天最多,21天最少。3组大鼠不同处死时间点大鼠脑感觉运动皮质区nestin阳性细胞的形态学观察:nestin阳性细胞呈大小不等的圆形,可见0-1个突起,胞浆呈棕黄色,胞核呈空泡状。sham组脑感觉运动皮质区可见少量散在分布的nestin阳性表达的神经前体细胞,control组和sham组可见nestin阳性表达的神经前体细胞在感觉运动皮质区呈明显的区域性分布,主要位于椎体细胞层和颗粒细胞层。不同时间点Nestin阳性细胞在分布区域、形态以及生长方式等方面存在一定的差异。3组大鼠不同处死时间点左侧大脑海马区Nestin阳性细胞检出率比较:使用析因设计资料的方差分析,结果显示组间差异有显著性（F=25.99,P＜0.001）,各实验组每一时间点的nestin阳性细胞数目从多到少分别为trial组＞control组＞sham组。不同时间点间差异也有显著性（F=10.832,P＜0.001）,随着时间的延长,nestin阳性细胞数大体呈下降趋势。实验组与时间之间不存在交互作用（F=0.509,P=0.729）,提示各实验组nestin阳性细胞检出率的变化趋势不随时间的变化而改变。3、远期行为学影响:control组大鼠的学习记功能严重不良伴海马结构严重受损,与sham组相比,水迷宫实验中平均逃逸潜伏期延长（54.51s与22.34s,P＜0.001）、搜索时间和搜索路程缩短（分别为31.15s与54.51s,5.53m与9.88m,均P＜0.001）;HBO治疗明显减轻缺氧缺血性脑损伤（HIBD）大鼠的学习记忆功能障碍（潜伏期:38.78s与54.51s;搜索时间:36.38s与31.15s;搜索路程:6.88m与5.53m,P＜0.001）。4、脑萎缩程度:control组缺氧缺血侧（左）大脑的重量较右侧轻,萎缩了（20.2±11.4）%;而HBO治疗能够减轻缺氧缺血侧大脑的萎缩程度,治疗后左侧大脑萎缩百分比为（8.5±8.3）%,低于control组（P=0.001）。且HBO治疗后大脑萎缩程度与sham组（3.5±5.7）%相比无显著性差异（P=0.560）。5、nissl染色:正常对照组椎体细胞排列整齐紧密,呈椭圆形,核仁清楚居中,细胞质中尼氏体清晰可见,均匀一致。Control组细胞排列紊乱,细胞间隙增宽;细胞质中尼氏体减少或消失,大量神经元表现出胞体显著缩小、着色加深等损伤特征,同时,神经元丢失现象也较为明显;与sham组比较,CA1区椎体细胞密度明显下降。trial组细胞排列整齐,CA1区椎体细胞密度明显增加;存活神经元数目较control组明显增多（P＜0.001）,而与sham组相比无统计学差异（P=1.0）。结论:1、HBO早期干预能够减轻HIBD所致的海马CA1区组织学损伤,改善由HIBD引起的学习记忆能力下降;2、HBO早期干预可增加海马区和感觉运动皮质区nestin阳性细胞的数目;3、内源性神经干细胞参与了新生鼠缺氧缺血性损伤后神经系统功能的重建过程;而HBO治疗能够在一定程度上放大内源性神经干细胞的这种作用,HBO早期干预可能是通过改变内源性神经干细胞所处的内环境来实现。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• HBO对新生鼠缺血缺氧性脑损伤的治疗效应及作用机制研究
• 第一章 前言
• 第二章 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 观察指标
• 2.4 应用SPSS11.5统计软件进行统计分析
• 第三章 结果
• 3.1 行为学观察结果
• 3.2 苏木素-伊红染色结果
• 3.3 免疫组化染色结
• 3.4 远期学习记忆能力测试结果
• 3.5 脑萎缩百分比
• 3.6 尼氏染色观察结果
• 第四章 讨论
• 4.1 新生儿缺氧缺血性脑损伤模型问题
• 4.2 新生儿缺氧缺血性脑损伤与内源性NSPs及nestin阳性表达
• 4.3 HBO治疗对HIBD新生大鼠的影响及其机制探讨
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录一 中英文名词缩写与对照
• 附录二 综述
• 致谢