论文摘要
【研究背景】终末期肝病为我国的常见病、多发病。肝脏移植是最佳治疗方法乃至唯一选择。随着手术技术不断完善,以及免疫抑制剂的应用,肝脏移植得到广泛开展,但肝脏移植后影响器官存活的最大障碍是受体对移植器官的排斥反应。抗排斥药物能够达到抑制肝脏移植排斥反应的效果,尽管其疗效较好,但由于其带来的全身免疫系统受抑、药物中毒及增加其他恶性肿瘤的发生率等严重的毒副作用,另外应用抗排斥药物所带来的高昂的治疗费用,其应用仍有一定的局限性。随着分子生物学的发展以及对排斥反应认识的不断深入,近10年来,人们将转基因技术引入了器官移植领域,阻断共刺激分子诱导免疫耐受的基因治疗在肝脏移植中已经成为一种新的途径。选择在肝移植排斥反应发展过程中起重要作用的基因作为靶点,是肝脏移植排斥反应转基因治疗的关键之一。随着对肝脏移植排斥反应发生、发展分子生物学机制的研究深入,已发现在肝脏移植排斥反应的发病过程中涉及到多个共刺激分子通路的过度表达。T细胞活化需要双信号;第一信号是TCR识别APCs上的抗原肽-MHC复合体,这一信号决定了T细胞活化特异性;第二信号是T细胞上的CD28与APCs上B7分子的结合形成的所谓CD28-B7共刺激通路,它对维持和进一步活化T细胞至关重要;之后,活化的T细胞表达CTLA4分子,CTLA4和CD28都是T细胞上与B7结合的同源受体,CTLA4与B7结合负调节T细胞的活化。当T细胞只有第一信号而缺乏第二信号时将导致该T细胞进入克隆无能状态,其后果是表现为特异性的T细胞免疫耐受。器官移植抗排斥反应的基因治疗包括:①免疫抑制相关基因的克隆与表达。人们试图通过向移植器官内转入特定目的基因（其多数表达产物具有调节免疫及炎症反应的活性）,使移植器官表达转基因产物,而获得局限于移植器官的区域性免疫抑制及炎症抑制。从而减缓排异反应和缺血再灌注损伤,并避免了应用免疫抑制剂所带来的毒副作用。目前常用的涉及共刺激通路的转基因研究方法为,用编码CTLA4Ig的cDNA腺病毒载体行体外灌注移植物（如肝脏、胰腺、心）,移植物局部表达的CTLA4Ig蛋白具有竞争性抑制CD28-B7共刺激通路的作用,免疫抑制作用仅限于移植物,没有全身反应。②另外反义基因技术也被用于器官移植时封闭免疫因子。可直接设计合成相关基因的反义寡核苷酸片段或克隆反义基因片段导入细胞表达反义RNA起作用。Poston等表明体外用反义细胞间粘附分子-1（ICAM-1）寡核苷酸转染大鼠移植心脏,可以减轻慢排反应。反义基因疗法是基因治疗重要组成部分,其基本原理是根据核酸碱基互补配对规律设计出能与靶基因特定区域结合的RNA或DNA,影响靶基因的表达,抑制其功能。B7/CD28是最早发现和研究最多最重要的共刺激分子通路,在多种实体器官移植中阻断B7-1表达对于诱导免疫耐受非常重要,甚至能够达到降低免疫药物用量或停用免疫抑止药物的作用。为了进一步研究B7-1反义基因对肝脏移植免疫耐受的诱导作用,我们构建了B7-1的反义真核表达载体,为上述工作的展开奠定一定的基础。【目的】:构建能在真核细胞表达的含大鼠B7-1反义基因片段的载体,为进一步研究B7-1反义基因抑制肝脏移植的排斥作用奠定基础。【方法】:1.设计含有XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点的一对引物,通过PCR技术扩增获取质粒载体pcDNA3-B7-1上的目的片段B7-1（426bp）,经过纯化的B7-1 cDNA和PMD18-T载体经过连接,转化,鉴定而得到中间载体质粒PMD18-T-B7-1。2.经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切PMD18-T-B7-1及pcDNA3B（-）真核表达载体后,使用T4DNA连接酶连接,构建反义B7-1表达载体。pcDNA3B（-）真核表达载体的XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点与B7-1全基因序列所含酶切位点相反。3.构建好的重组质粒采用PCR、酶切及测序鉴定。【结果】:1.反义基因重组体经过XhoⅠ和BamHⅠ双酶切和以重组体为模板进行PCR检测,得到420bp左右的目的基因片段。2.基因测序证实所克隆的目的片段为420bp,并成功连接到质粒载体pcDNA3B上,测序证明,插入的目的片段碱基序列与Genebank报道的完全一致,且反方向插入载体。【结论】:成功构建了大鼠B7-1反义真核表达载体,为研究器官移植时阻断B7-1/CD28共刺激通路抑制排斥反应的发生奠定了基础。
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