人瘦蛋白基因在大肠杆菌中表达的研究

论文摘要

瘦蛋白是肥胖基因在脂肪组织中表达的产物,是反映体内脂肪组成及体内脂肪含量和调节体重的重要信号因子。本研究参考相关文献设计引物,经68℃退火及30轮循环的PCR程序后克隆了位于质粒载体上的瘦蛋白基因约460bp的片段,将该片段从琼脂糖凝胶中回收,克隆在pMD18-T测序载体中进行序列测定。经测序鉴定正确后,直接对重组的pMD18-T-OB测序质粒进行双酶切,并回收约460bp的瘦蛋白基因片段,然后把回收产物与同样经双酶切的pET-28a（+）表达载体进行连接,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞后,挑选在抗性平板上生长的菌落进行液体培养并提取质粒进行双酶切鉴定,从而最终获得重组成功的表达质粒。用构建的pET-28a （+）-OB重组表达质粒转化大肠杆菌DH5α及BL21（DE3）菌株,进行不同浓度IPTG、在不同时间下的诱导表达,然后对菌体蛋白进行SDS-PAGE分析,鉴定重组基因是否得到表达。结果表明,瘦蛋白在BL21（DE3）菌株中得到大量表达,而在DH5α中则检测不出预期大小的蛋白质,这说明能高效表达人瘦蛋白的大肠杆菌BL21（DE3）（pET-28a（+）-OB）基因工程菌构建成功。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 肥胖基因与瘦蛋白研究进展
• 1.1.1 肥胖基因与肥胖
• 1.1.2 瘦蛋白在人体代谢中的作用
• 1.2 大肠杆菌基因表达系统
• 1.2.1 大肠杆菌用于外源基因的表达
• 1.2.2 宿主细胞的影响
• 1.2.3 肥胖基因表达的研究进展
• 1.3 本实验的研究方法及前期研究
• 1.3.1 本实验研究方法的确立
• 1.3.2 本实验室前期研究成果
• 第二章 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒模板
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 菌株及酶类
• 2.1.4 培养基的配置
• 2.1.5 主要缓冲液及试剂的配置
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 人瘦蛋白基因的 PCR 扩增
• 2.2.2 目的片段的回收
• 2.2.3 重组质粒的连接、筛选和转化
• 2.2.4 重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.5 DNA 的序列测定
• 2.2.6 Leptin 在大肠杆菌中的诱导表达与检测
• 第三章 结果和分析
• 3.1 质粒p22 的 PCR 扩增结果
• 3.2 回收的 PCR 产物电泳结果
• 3.3 回收片段与pMD18-T 载体连接、转化后的质粒提取及酶切鉴定结果.
• 3.4 重组的测序质粒载体的测序结果
• 3.5 从重组的 T 载体上双酶切回收人瘦蛋白基因，及pET-28a（+）载体的双酶切回收
• 3.6 人瘦蛋白基因大肠杆菌表达载体的构建
• 3.7 人瘦蛋白基因在大肠杆菌 DH5α菌株中的表达与SDS-PAGE 检测
• 3.8 人瘦蛋白基因在大肠杆菌 BL21（DE3）菌株中的表达与检测
• 3.8.1 大肠杆菌 BL21（DE3）菌株的活化培养、感受态细胞制备与pET-28a（+）重组质粒的转化鉴定
• 3.8.2 人瘦蛋白基因在转化的大肠杆菌 BL21（DE3）菌株中的表达与SDS-PAGE 检测
• 第四章 讨论
• 4.1 关于引物的设计
• 4.2 PCR 扩增反应条件
• 4.2.1 Taq DNA 聚合酶与扩增温度
• 4.2.2 关于模板使用量
• 2+ 浓度'>4.2.3 dNTP 与Mg²⁺浓度
• 4.3 关于凝胶电泳
• 4.4 转化和连接对筛选重组质粒效率的影响
• 4.5 克隆用载体
• 4.6 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达培养及检测
• 4.6.1 IPTG 浓度
• 4.6.2 表达培养温度
• 4.6.3 质粒结构
• 4.6.4 宿主因素
• 4.6.5 RNA 的影响
• 4.6.6 培养基组成与条件的影响
• 4.7 重组质粒pET-28a（+）-OB 在大肠杆菌 DH5α菌株与 BL21（DE3）菌株中表达量存在巨大差异的原因比较分析
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者在读期间发表的相关论文
• 附页