AP-2α表达降低引起EGF receptor过表达以及SW480细胞体外恶性增殖与侵袭能力增强

论文摘要

目的:转录因子AP-2α（Transcription factor activator protein-2α）属于转录因子AP-2（Transcription factor activator protein-2,AP-2）家族,是一种特异性DNA结合蛋白,分子量约为52kD。AP-2α作为一种特异性核转录因子调控多种靶基因的表达,参与调节胚胎发育以及细胞的生长分化。国外研究发现,AP-2α在多种肿瘤包括结直肠癌中表达降低或缺失,提示AP-2α在结肠癌发生发展中起着肿瘤抑制基因的作用。本研究进一步探讨AP-2α的表达降低或缺失参与结肠癌发生发展的作用机制。方法:本研究采用基因工程技术,以pcDNA3.1（+）为表达载体,构建了携带野生型AP-2α基因的pcDNA3.1（+）-hAP-2α真核表达质粒;在脂质体介导下将pcDNA3.1（+）-hAP-2α和pcDNA3.1（+）分别转染人结肠癌细胞株─SW480细胞,利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot分析与凝胶迁移率变动分析（EMSA）对AP-2α在SW480细胞中的表达及其活性进行鉴定;利用MTT法和软琼脂克隆形成试验体外观察AP-2α对SW480细胞恶性增殖能力的影响;利用Transwell侵袭试验体外观察AP-2α对SW480细胞侵袭能力的影响。利用PCR技术从SW480细胞基因组DNA中扩增表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor, EGF receptor）基因启动子,将其构建入pMD-18T载体,并进行测序;根据该段启动子区域中5个可能的AP-2α结合位点设计5对寡核苷酸探针,利用EMSA技术体外水平检测各组细胞的核蛋白与这5对寡核苷酸探针的结合情况;进一步利用RT-PCR技术和Western blot分析检测转染AP-2α基因后SW480细胞中内源性EGF receptor基因的表达。结果:成功构建携带野生型AP-2α基因的pcDNA3.1（+）-hAP-2α真核表达质粒;野生型AP-2α基因在人结肠癌细胞株─SW480细胞中获得高水平表达,并且表达的AP-2α蛋白具有较强的DNA结合活性;MTT结果提示转染AP-2α基因后SW480细胞增殖趋缓,软琼脂克隆体积小且数量少,细胞侵袭能力下降。成功扩增SW480细胞基因组DNA中EGF receptor基因的启动子区域,并构建入pMD-18T载体,测序结果显示该段启动子区域未发现有任何可能导致反式作用因子结合能力异常的基因缺失、重排或者突变;EMSA结果显示,SW480细胞中表达的AP-2α蛋白与3对探针发生特异性结合,且结合强度不等;转染AP-2α基因后,SW480细胞中内源性EGF receptor mRNA含量和蛋白表达水平显著下调。结论:转录因子AP-2α可以抑制人结肠癌细胞株─SW480细胞体外恶性增殖以及侵袭能力,其作用机制可能与通过直接作用于EGF receptor基因启动子区域从而下调内源性EGF receptor基因的表达有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 材料与方法
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 第二章 实验结果
• 1 pcDNA3.1（+）-hAP-2α真核表达载体的构建
• 2 AP-2α在SW480 细胞中的表达及其活性鉴定
• 3 AP-2α抑制SW480 细胞体外恶性增殖能力
• 4 AP-2α抑制SW480 细胞体外侵袭能力
• 5 SW480 细胞基因组DNA 中EGF receptor 基因启动子序列测定
• -79～-105、P_-179～-206以及_P-237～-258 区域'>6 AP-2α直接作用于EGF receptor 基因启动子中P_-79～-105、P_-179～-206以及_P-237～-258区域
• 7 AP-2α下调SW480 细胞中内源性EGF receptor 基因的表达
• 第三章 讨论
• 参考文献
• 综述
• 个人简介
• 致谢