人类心脏发育候选基因AHNAKβ的表达与功能研究

论文摘要

心脏发育过程是一个错综复杂的过程,其发育过程是由一系列的基因参与完成的。虽然目前已经鉴定出很多心脏发育相关的基因,但是仍有很多心脏发育相关基因有待鉴定。本文作者为了研究与心脏发育和心脏疾病相关的基因,利用生物信息学分析,从人类心脏cDNA文库中分离并鉴定了一个心脏发育候选基因AHNAKβ。AHNAKβ（登录号NM024060）位于11q12.2,长1108bp,由6个外显子和5个内含子组成,其中开放阅读框（ORF）长450bp （301-750 nt）,编码含有149个氨基酸,蛋白质大小约为16.0KD。它是AHNAK的第二个转录剪接体。第一个转录剪接体AHNAKa的cDNA为18815个碱基,编码一个680KD的巨型蛋白。通过BLAST比对,我们发现AHNAKα与AHNAKβ的N端是一样的,但是AHNAKβ的C端与a完全不一样。因为已知AHNAKα具有控制心肌收缩的作用,提示AHNAKβ可能与心脏发育相关。为了研究AHNAKβ基因的蛋白表达模式,我们首先制备该基因的多克隆抗体。我们利用制备的多克隆抗体研究该基因在蛋白水平的表达模式。组织Western blot结果表明,该基因在小鼠成体中心脏和肠的表达最强,其次在子宫的表达较强,在脾脏和肾有微弱的表达。为了更好的研究这个基因在心脏发育过程中的时空表达模式,我们进一步利用小鼠不同发育阶段的胚胎材料,通过胚胎原位杂交和免疫组化分析该基因的时空表达模式。首先选择AHNAKβ的C端的特异碱基序列作为探针。胚胎原位杂交结果表明,该基因在小鼠胚胎中的心脏组织表达最强,在肌肉和脑的表达较强。其次利用抗体进行免疫组化分析,研究结果表明,AHNAKβ蛋白在心脏,肌肉和脑中表达,其中以心脏和脑表达最为强烈。我们进一步利用新生小鼠原代心肌细胞检测AHNAKβ蛋白在细胞中的分布状况。免疫荧光实验检测结果表明AHNAKβ蛋白定位于心肌细胞细胞质中。进一步利用免疫电镜技术观察表明,该基因在心肌细胞中的肌丝和线粒体上大量表达。为了研究AHNAKβ相互作用蛋白,我们通过酵母双杂交技术,从成人心脏文库中筛选并鉴定到8个与AHNAKβ发生相互作用的蛋白质,其中TNNI3是一个与心脏特异性表达的基因,它与家族性肥厚型心肌炎的发生有着密切的关系。为了进一步证明AHNAKβ和TNNI3是否发生相互作用,我们通过免疫共沉淀实验进行验证,结果证明AHNAKβ和TNNI3在体内确实存在相互作用。上述结果表明AHNAKβ在小鼠心脏的各个发育阶段中表达,提示它在心脏发育过程中可能起着一个重要的作用。这为以后深入地研究人类AHNAKβ在心脏方面的功能打下了良好的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 心脏早期发育研究简述
• 1.2 调控脊椎动物心脏发育的基因
• 1.2.1 GATA
• 1.2.2 Nkx2.5
• 1.2.3 MEF-2家族
• 1.2.4 HAND基因
• 1.2.5 BMP家族
• 1.3 小鼠心脏的形态建成
• 1.4 本课题的研究意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 生物信息学软件
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 细胞、菌株和质粒
• 2.1.4 主要实验仪器和耗材
• 2.2 方法
• 2.2.1 AHNAKβ全长序列的计算机分析
• 2.2.2 用PCR反应从小鼠心脏cDNA文库中分离AHNAKβ.
• 2.2.3 重组质粒的构建
• 2.2.4 原核细胞诱导蛋白质表达及纯化
• 2.2.5 多克隆抗体的制备与纯化
• 2.2.6 胚胎各组织蛋白的提取与检测
• 2.2.7 酵母双杂交
• 2.2.8 免疫共沉淀
• 2.2.9 常规细胞培养及转染
• 2.2.10 小鼠整胚原位杂交
• 2.2.11 胚胎原位杂交预处理
• 2.2.12 小鼠胚胎的预杂交和杂交
• 2.2.13 胚胎杂交后的处理
• 2.2.14 抗体反应后漂洗和杂交信号的免疫检测
• 2.2.15 小鼠心肌细胞分离方法
• 2.2.16 免疫组化
• 第三章 实验结果及其分析
• 3.1 人类AHNAKβ基因的生物信息学分析
• 3.1.1 AHNAKβ克隆和序列分析
• 3.1.2 AHNAKβ与AHNAKα的剪切方式比较
• 3.2 小鼠AHNAKβ基因的克隆
• 3.3 AHNAKβC蛋白表达及抗体制备
• 3.3.1 原核蛋白表达质粒构建
• 3.3.2 蛋白表达及纯化
• 3.3.3 AHNAKβ多克隆抗体制备
• 3.4 AHNAKβ基因在小鼠成体中的表达
• 3.5 AHNAKβ小鼠整体胚胎原位杂交结果
• 3.6 AHNAKβ小鼠整体胚胎免疫组化结果
• 3.7 小鼠原代培养细胞AHNAKβ的免疫荧光
• 3.8 免疫电镜实验结果
• 3.9 AHNAKβ酵母双杂交
• 3.10 用免疫共沉淀分析AHNAKβ与TNNI3的相互作用
• 第四章 讨论
• 4.1 相互作用的探讨
• 4.2 TNNI3的功能
• 总结
• 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢